人巨细胞病毒包膜糖蛋白B的B细胞抗原表位预测

目的:通过生物信息学方法分析人巨细胞病毒包膜糖蛋白B(gB)的三级结构并预测其线性B细胞抗原表位.方法:根据人巨细胞病毒gB蛋白的胞外域序列,利用DNAStar软件分析其二级结构和表面特性,联合在线B细胞表位预测程序BcePred,通过其理化特性来综合预测该蛋白可能的线性B细胞抗原表位;利用SWISSMODEL服务器的同源建模方法构建gB蛋白的三级结构模型,对在生理三聚体条件下该蛋白各预测表位进行验证.结果:成功预测出人巨细胞病毒gB蛋白的多个线性B细胞抗原表位区段,其中预测出的5个表位区段不属于任何已发现的抗原区域,为后续验证其优势中和表位,研制安全、高效的表位疫苗奠定了理论基础.

人巨细胞病毒包膜糖蛋白B主要中和表位单克隆抗体的制备

人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)分布广泛,能够引发多种疾病,人群感染率极高,严重威胁到人类健康。现根据标准毒AD169基因序列,人工合成包膜糖蛋白B(glycoprotein B,g B)AD13区段的主要中和抗原表位AD-1、AD-2、AD-3,并将其与表达载体pET-32a连接,构建重组表达质粒;用IPTG诱导表达重组蛋白,采用Western-blot进行特异性鉴定;将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,然后筛选制备AD13单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab)。12%SDS-PAGE电泳鉴定表明重组蛋白表达成功,其相对分子质量约为35 kD;Western-blot和间接ELISA结果说明,重组AD13蛋白作为抗原具有良好的免疫反应性;克隆化后筛选到5个AD13单克隆抗体细胞株,经间接ELISA鉴定,与AD13抗原有良好的特异性反应。上述研究为研发HCMV快速诊断试剂盒提供了原料,也为研究HCMV亚单位疫苗提供了相关的基础。

不孕女性中人巨细胞病毒包膜糖蛋白B基因的分型

目的:探讨不孕女性中人巨细胞病毒(HCMV)感染流行株的包膜糖蛋白B(gB)基因型分布及其与不孕的相关性。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测300例女性不孕患者血清中HCMV-IgM抗体,ELISA阳性的患者采集晨尿接种于人胚肺成纤维细胞(HELF),提取细胞病变(CPE)阳性培养液中的病毒DNA,以巢式PCR(nest PCR)法扩增HCMVgB基因,利用限制性核酸内切酶HinfΙ、RsaΙ对HCMV gB基因进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析判断基因型别;随机抽取11例送检测序,测序结果使用Clustal X软件与GenBank标准病毒株进行序列比对,用MEGA4.1构建核苷酸序列的基因树。结果:300例女性不孕患者中HCMV-IgM抗体阳性45例,阳性率为15.0%。45例患者晨尿接种HELF细胞,观察1月后检测到的病毒阳性37例,阳性率为12.3%。37例病毒阳性患者中最常见的基因型为gB 1型25例(67.6%),其次为gB 3型7例(18.9%)和gB 2型5例(13.5%),没有检测到gB4基因型。测序结果与GenBank标准病毒株HCMVADl69和Towne进行序列比对后,用MEGA4.1成功构建基因树。结论:女性不孕症的发生与HCMV感染有明显相关性,HCMV感染导致的不孕中最常见的gB基因型为gB 1型,其次是gB 3、gB 2型,未检测到gB 4型。

乙型脑炎病毒膜蛋白B区多肽抗原的表达、纯化及血清学评价

目的在原核表达系统中对乙型脑炎病毒包膜糖蛋白(E蛋白)的B区多肽抗原进行高效表达、纯化及血清学评价。方法利用PCR技术从乙脑减毒活疫苗中扩增编码B区的DNA片段,酶切消化后连接到表达载体pET22b上,用此连接产物转化大肠埃希菌BL21(DE3)并表达B区多肽抗原,表达产物经液相层析纯化;用乙脑病人血清对纯化后的B区多肽抗原进行评价。结果重组质粒pET22b-JEB经双酶切,其插入的外源基因片段为372 bp,与预期DNA片段大小一致。将纯化前与纯化后的蛋白作SDS-PAGE电泳,均可见一条约16kD的外源基因蛋白带,与计算的相对分子质量相符。经WB和ELISA血清学评价,表明重组B区多肽抗原具有较高的灵敏性及特异性。结论成功构建了表达载体pET22b-JEB,在原核系统中表达的B区多肽抗原具有良好的血清学检测价值。