Ⅰ型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区中和抗体的制备与鉴定

目的研制Ⅰ型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区(dengue virus 1 envelope protein domainⅢ,DENV-1 EDⅢ)单克隆抗体,并鉴定其血清型特异性、相对表位和中和活性。方法采用DENV-1 EDⅢ重组蛋白为免疫原,免疫Balb/c小鼠,制备抗DENV-1 EDⅢ单抗,鉴定单抗的免疫学特性和交叉反应性,噬斑减少中和实验鉴定其中和活性,抗体与抗体间竞争抑制分析相对表位。结果共获得抗DENV-1 EDⅢ单抗28株,其Ig亚类鉴定24株为Ig G1,2株为Ig G2a,2株为Ig G2b,包含13株DENV-1血清型特异性单抗,9株DENV病毒特异性单抗,其它6株交叉反应性单抗以不同的方式同各型DENV EDⅢ反应,至少识别5个不同位点,其中27株抗体对不同血清型登革病毒表现出不同的中和活性。结论成功获得了针对DENV-1 EDⅢ的特异性单抗及交叉性中和单抗,将为进一步研究登革病毒EDⅢ蛋白的结构与功能、疫苗和治疗性抗体的研发奠定基础。

甲醇诱导条件对登革病毒四型联合重组包膜蛋白Ⅲ区表达的影响

目的探讨甲醇诱导浓度和诱导时间对登革病毒(dengue virus,DENV)四型联合重组包膜蛋白Ⅲ区(envelope domainⅢ,EDⅢ)表达的影响,以期实现该蛋白在毕赤酵母中的高效表达。方法采用不同浓度甲醇(0. 05%、0. 1%、0. 25%、0. 5%、0. 75%、1%、1. 5%、2%、2. 5%、3%、5%、7. 5%)诱导表达带His标签的DENV四型联合重组EDⅢ蛋白,分别诱导18、24、30、48、72 h,样品经Western blot检测。最佳条件下诱导表达的蛋白液经Ni-Agarose His亲和层析纯化后,进行10%SDS-PAGE检测。结果最佳甲醇诱导浓度为2. 5%,最佳甲醇诱导时间为72 h。纯化产物经10%SDS-PAGE检测,于相对分子质量约41 000处可见单一目的蛋白条带,纯度为99%。结论当甲醇浓度为2. 5%,诱导时间为72 h时,可实现DENV四型联合重组EDⅢ蛋白在毕赤酵母中的高效表达。

双抗原夹心ELISA法检测登革病毒感染患者血清中的EDⅢ抗体

目的建立一种检测登革病毒(dengue virus,DENV)特异性抗体的双抗原夹心ELISA方法。方法利用毕赤酵母系统表达4个血清型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区(envelope protein domainⅢ,EDⅢ),并采用改良过碘酸钠法对EDⅢ蛋白标记辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP),建立一种可同时检测4个血清型登革病毒EDⅢ蛋白特异性抗体的双抗原夹心ELISA法。并对2014年广州珠江医院门诊和住院确诊的登革热患者血清标本进行检测,并与澳洲Panbio MAC ELISA检测的敏感性进行比较。结果本研究成功建立了一种检测4个血清型登革病毒EDⅢ蛋白特异性抗体的双抗原夹心ELISA法,该方法能同时检测到4个血清型登革病毒EDⅢ蛋白免疫的小鼠血清和Ⅰ型登革病毒EDⅢ蛋白免疫的兔血清,而与烟曲霉AF-MP蛋白免疫的小鼠血清和兔血清均无交叉反应。对184份健康人血清标本检测全为阴性,而对168份确诊为登革病毒感染患者血清标本检测结果表明,两种诊断方法检测结果差异无统计学意义,P<0.001(57.1%vs 57.7%),联合NS1抗原检测方法,其敏感性提高到97.6%。结论双抗原夹心ELISA法检测登革病毒EDⅢ特异性抗体具有高度的特异性,但如果能同时联合抗原检测可明显提高登革热的早期诊断率。

Ⅰ～Ⅳ型登革病毒包膜蛋白B细胞中和表位的鉴定

登革病毒包膜蛋白（Dengue virus envelope protein,DENV E）是诱导中和抗体主要的蛋白,登革病毒包膜蛋白Ⅲ区（Dengue virus envelope protein domainⅢ,DENV EDⅢ）是构建DENV亚单位疫苗的主要靶标,但是其B细胞中和表位目前了解不多。我们采用两组覆盖DENV-1EDⅢ的重叠多肽（12肽和16肽）同27株针对DENV-1EDⅢ中和单抗反应,筛选DENV EDⅢ上B细胞表位。采用该方法,我们发现了一高度保守的Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位和一高度保守的DENV-1血清型特异性B细胞中和表位,分别位于DENV-1E蛋白氨基酸残基序列第309~320位和第381~392位（Amino acid residues 309~320,and 381~392;aa 309~320和381~392）。Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位在Ⅰ～Ⅳ型DENV分离株中存在高度保守共同序列310 KEVAETQHGT319,DENV-1E蛋白中E309、V312、A313和V320不影响蛋白抗原性。DENV-1血清型特异性B细胞中和表位（DENV-1E蛋白氨aa 381~392）在DENV-1分离株中高度保守,在黄病毒属其它病毒中不保守。我们也发现一具有DENV-1分离株特异性的B细胞中和表位位于DENV-1E蛋白氨基酸残基序列第329~348位。这些新发现的DENV-1E蛋白EDⅢ上B细胞中和表位可能有助于研制新的DENV亚单位疫苗。