四种血清型登革病毒包膜蛋白结构域Ⅲ(EDⅢ)中和抗体的制备及鉴定

目的制备四种血清型交叉反应性的登革病毒包膜蛋白结构域Ⅲ(DENV-EDⅢ)特异性单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性及体外中和活性。方法通过毕赤酵母表达具有良好抗原性的1~4型DENV-EDⅢ蛋白,并以四种DENV血清型EDⅢ蛋白混合免疫BALB/c小鼠,采用聚乙二醇融合技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA筛选出稳定分泌抗DENV-EDⅢ抗体的杂交瘤细胞,进一步通过间接免疫荧光法对所获得mAb的特异性进行鉴定,并通过改良的酶联免疫斑点微中和实验对所获得的mAb进行体外中和活性测定。结果获得6株特异性针对1~4型DENV-EDⅢ蛋白的mAb和11株特异性针对某一血清型DENV的EDⅢmAb,其中有1株mAb同时对四种血清型DENV有均衡的体外强中和活性,其对四种血清型DENV的半数抑制剂量(IC)分别为(0.05、1.89、0.02、3.91)μg/mL。结论成功筛选获得了一株可同时中和四种血清型DENV的EDⅢ特异性mAb。

重组登革病毒包膜蛋白第Ⅲ结构域抑制登革病毒感染的研究

目的通过原核基因工程技术获得登革2型病毒(DENV2)包膜蛋白第Ⅲ结构域(EDⅢ)重组蛋白,检测其抑制登革病毒感染细胞的效率。方法利用聚合酶链反应技术扩增DENV2编码EDⅢ重组蛋白的基因片段,构建pET28b(+)-EDⅢ原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导EDⅢ重组蛋白表达,进行质谱鉴定。将登革病毒感染VeroE6细胞(经EDⅢ重组蛋白孵育),根据空斑减少数量计算EDⅢ重组蛋白对登革病毒感染的抑制率。结果成功表达并纯化EDⅢ重组蛋白。EDⅢ重组蛋白可以抑制登革病毒感染的VeroE6细胞,且抑制率与蛋白水平呈正相关,当蛋白水平为100μg/mL时,病毒抑制率为90.5%。结论DENV2 EDⅢ重组蛋白能够抑制DENV2吸附和感染细胞,为以EDⅢ重组蛋白为靶标研制药物和疫苗提供重要的实验基础。

登革病毒EDⅢ特异性单抗的体内外中和活性观察

目的鉴定1株能同时识别登革病毒Ⅰ～Ⅳ型(dengue virus serotypesⅠ-Ⅳ,DENV 1～4)的EDⅢ特异性单抗2D73的体内外中和活性。方法采用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)和间接免疫荧光法(IFA)对单抗2D73的特性进行鉴定,并用基于酶联免疫斑点法的微中和实验(ELISPOT-MNT)和乳鼠保护实验观察单抗2D73对DENV 1～4的体内外中和活性。结果单抗2D73对4型DENV均具有较强的中和活性,其50%抑制浓度(IC50)分别为0.28、0.16、0.18和18.82μg/ml。乳鼠保护实验显示,该抗体对DENV 1～4同样具有较好的体内保护效果,与对照组相比,实验组小鼠发病时间明显延迟,生存率显著提高(P<0.05)。结论获得1株同时针对DENV1～4且具有体内外中和活性的单抗,该单抗可进一步用于DENV致病和免疫机制的研究以及抗病毒药物的研制。