匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)As3.38△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆与酵母表达

通过气相色谱法(GC)快速分析8种真菌的脂肪酸成分,发现匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)具有较高的γ-亚麻酸含量,利用RT-PCR和RACE方法获得了全长为1475bp的匍枝根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的cDNA序列,其中开放阅读框为1380bp,编码459个氨基酸。生物信息学分析所克隆的基因具有△6-脂肪酸脱氢酶的典型结构:N端具有细胞色素b5结构、具有3个保守的组氨酸区序列和跨膜结构;把该基因的开放阅读框序列连接到表达载体pYES2.0上,构建重组表达载体pYRnD6D,并将其转入缺陷型酿酒酵母INVScl中进行表达。GC分析表明,该序列在酵母中获得了表达,表达产物表现出△6-脂肪酸脱氢酶的酶学活性,能将底物亚油酸转化为γ-亚麻酸。新生成的γ-亚麻酸占酵母细胞总脂肪酸的12.25%。

8种杀菌剂对甘薯匍枝根霉的室内毒力及贮藏期药效评价

甘薯软腐病是贮藏期的一种重要真菌病害,发生普遍,为害严重,匍枝根霉为软腐病的主要致病菌。为测定不同药剂对匍枝根霉的毒力水平,明确药剂对甘薯软腐病的防治效果,对实际生产提供有效指导,采用平皿分析法测定8种杀菌剂对匍枝根霉的毒力并进行了贮藏期药效试验。毒力测定结果表明,8种杀菌剂EC50由低到高分别为:50%咯菌腈、10%苯醚甲环唑、50%异菌脲、32.5%苯甲嘧菌酯、12.5%腈菌唑、80%烯酰吗啉、50%咪鲜胺锰盐、25%溴菌·多菌灵,EC50分别为0.1422、7.5133、8.4786、11.3104、16.3595、62.6331、78.6684、91.1605μg/mL。其中50%咯菌腈EC50值显著低于其他7种药剂,毒力最强,抑制效果最好。贮藏期药效试验结果表明,贮藏45 d时,50%咯菌腈处理薯块发病率最低,为3.33%,防效最高,为90.63%,显著高于其他各处理,10%苯醚甲环唑、50%异菌脲、32.5%苯甲·嘧菌酯和12.5%腈菌唑处理防效均在60%~80%间;贮藏90 d时,50%咯菌腈处理薯块发病率仍最低,为5.56%,防效仍最高,为86.49%,显著高于其他各处理。10%苯醚甲环唑、50%异菌脲、32.5%苯甲·嘧菌酯和12.5%腈菌唑处理防效均在60%~75%间。在甘薯软腐病的防治中,生产上可推广使用50%咯菌腈可湿性粉剂对贮藏期甘薯软腐病进行防治。

匍枝根霉和半裸镰刀菌侵染甜瓜果实产生的胞壁降解酶与侵染方式

匍枝根霉（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）和半裸镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍ）以不同的机制侵染甜瓜果实。匍枝根霉侵染时，菌丝分泌大量的果胶甲酯酶（ＰＭＥ）、多聚半乳糖醛酸酶（ＰＧ）、果胶甲基半乳糖醛酸酶（ＰＭＧ），迅速消解组织中胶层，引起细胞电解质外渗、质壁分离和软腐。菌丝在胞外和细胞间隙生长，不能穿透细胞壁。半裸镰刀菌侵染甜瓜果实时分泌高活力的果胶甲酯酶、果胶裂解酶类（ＰＭＬ）和纤维素酶（Ｃｅｌｕｌａｓｅ）而缺少果胶水解酶类，菌丝不能迅速消解中胶层，但以直接穿透细胞壁方式侵染组织细胞。这两种病原对甜瓜不同的致腐方式是由它们不同的外泌胞壁降解酶种类和酶学特性所决定的。

酸性硫酸钙处理对水蜜桃采后匍枝根霉致病力的影响

为研究酸性硫酸钙(ACS)溶液对水蜜桃果实采后致腐匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)的抑菌效果,在离体和体内条件下,探究其对匍枝根霉细胞膜渗透率、细胞壁降解酶、呼吸相关酶活性和桃果发病率的影响。结果表明,不同稀释倍数的ACS溶液对匍枝根霉均有不同程度的抑菌作用,其中ACS-10^(-3)处理组的抑菌效果最强。在作用120 min时,ACS-10^(-3)组菌丝细胞膜渗透率达到52.76%,较CK高出39.72%;匍枝根霉在含有50%ACS稀释液的带药培养基中培养9 d时,ACS-10^(-3)组的PG、PMG、C_X和GLU等细胞壁降解酶活性得到了抑制,较CK分别降低38.41%、41.96%、59.31%和35.52%;且在很大程度上抑制了呼吸能量代谢系统中酶活性的上升,培养第9天时匍枝根霉的SDH、MDH和IDH活性分别为0.02±0.01、0.68±0.12、106.13±3.54 nmol·min^(-1)·g^(-1),均显著低于CK(P<0.05)。同时,ACS稀释液可显著降低损伤接种桃果实的匍枝根霉病斑面积和接种发病率,与CK相比,ACS-10^(-3)组桃果实的匍枝根霉病斑面积和接种发病率分别降低了99.61%和73.33%。因此,适宜稀释倍数的ACS溶液能够有效抑制水蜜桃采后因匍枝根霉侵染引起的软腐病。

匍枝根霉TP-02内切葡聚糖酶基因eg2的克隆表达及功能分析

从匍枝根霉TP-02的cDNA文库中克隆得到内切葡聚糖酶基因eg2,在大肠杆菌BL21中成功表达,通过对其结构功能进行初步分析,并对EGⅡ的纤维素结合模块CBM1及催化结构域GH45区进行突变研究。结构分析表明:N39S可影响CBM1亲水平面的形成,V136D及E260D对GH45活性中心的改变较大。突变株的发酵特性显示,N39S可缩短达到峰值的时间,V136D及E260D可显著提高酶活。其中,突变株EGⅡ-F在发酵21 h后,酶活达到最高为1.321 IU/mL,比突变前提高了82.7%。

山梨酸钾对面包上匍枝根霉的抑制作用

以匍枝根霉孢子为研究对象，通过改良固体培养法进行培养，并观察和统计匍枝根霉孢子的萌发情况、菌落大小和色泽、菌丝生长变化情况及孢子囊的形态特征，分析不同浓度山梨酸钾对抑制匍枝根霉生长的效果。结果表明：山梨酸钾对匍枝根霉具有显著的抑制作用，且抑制作用随其浓度升高而增强，当浓度≥0．8g／100mL时，抑菌效果已达到显著水平；当浓度为1．0—1．2g／100mL时，可抑制79％～90％根霉孢子的萌发，抑制菌丝及菌落生长且加速其老化、衰退。

匍枝根霉纤维素酶发酵条件优化及分批发酵动力学模型的构建

以滤纸酶活为检测指标,通过单因素实验和均实验设计优化匍枝根霉产纤维素酶培养条件,并以此为基础进行分批发酵,并利用Logistic方程和Luedeking-Piret方程构建动力学模型。优化结果表明:滤纸酶活在发酵时间为84 h时达到13.16 IU/mL,比优化前提高了149%,其中,内切酶活、外切酶活和β-葡萄糖苷酶活高值分别为45.81 IU/mL、0.537 IU/mL和12.45 IU/mL且所建模型拟合良好。

二氧化氯在巨峰葡萄表面杀灭匍枝根霉效果的研究

用ClO2溶液浸泡处理已接种匍枝根霉孢子的巨峰葡萄,研究了ClO2浓度,处理时间和pH值三个因素对杀菌效果的影响。结果表明:(1)ClO2浓度是影响杀菌效果的重要因素,随着浓度的增加杀菌效果有大幅度的提高;(2)处理时间延长可提高杀菌效果,但其上升趋势随时间延长将变得平缓;(3)较低的pH值有利于ClO2杀菌作用的发挥。

拮抗匍枝根霉的生防菌R1B的筛选鉴定和抑菌活性分析

为防治梨软腐病,从不同植物内生菌中筛选匍枝根霉拮抗菌,同时研究其生防活性。用对峙培养法筛选拮抗匍枝根霉的内生菌;采用果实打孔接种法检验R1B对梨软腐病的防治效果,初步探讨其抗菌活性物质。结果显示来自霍山石斛的菌株R1B对匍枝根霉具有较好的拮抗活性,生理生化和分子鉴定表明R1B与贝莱斯芽孢杆菌具有最近的亲缘关系。菌株R1B几乎完全抑制匍枝根霉菌丝的生长;接种匍枝根霉4 d后,R1B完全抑制梨软腐病的发生,而对照全部腐烂。R1B中含有抗菌肽合成基因bacA(溶杆菌素)、ituC(伊枯草菌素)、bmyB(杆菌抗霉素)及fenD(丰原素)。抗菌二肽溶杆菌素以及伊枯草菌素和丰原素可能是菌株R1B合成的抗菌物质。R1B具有防治梨软腐病的良好潜力。

匍枝根霉固态发酵产木聚糖酶条件研究

木聚糖酶作为环保型饲料添加剂广泛应用于畜牧业,因其具有改善消化道功能、降低食糜黏度和抗营养性、提高饲料利用率及减少环境污染等特点而备受关注。试验首先通过单因素试验法得到了最佳的氮源、料液比、无机盐和表面活性剂,为进一步提高产木聚糖酶的水平,以玉米芯粉为主要基质,采用响应面分析法优化匍枝根霉产木聚糖酶发酵培养基。优化的培养基为尿0.15、ZnSO40.022、Tween-80 0.08及含水量3 g/g干基质(DS),在最佳培养条件下,经7 d发酵酶活达到最大值:13.899 8 U/g DS。

基于响应面法优化匍枝根霉TP-02液态发酵纤维素酶条件

利用Plackett-Burman设计法(Plackett-Burman,PB),对影响根霉TP-02液态发酵产纤维素酶的8个因子进行了筛选,结果表明,影响该菌发酵产纤维素酶的主要因子为麸皮与稻草的比例、槐糖、Tween 80。利用最陡爬坡试验逼近最大响应区域,在此基础上,采用响应面法(ResponseSurface Methodology,RSM)对这3个因子的影响进行研究,得出纤维素酶产量的数学模型,通过对二次多项回归方程求解,得到3个因子的最优用量:麸皮稻草比例为:3.7:1,槐糖量为:0.62%,Tween 80为0.68 g/L,在优化后的条件下培养96 h,纤维素酶滤纸酶活可达到8.13 IU/mL比优化前提高了38.97%。

匍枝根霉液态发酵产木聚糖酶培养基优化研究

利用响应面法对匍枝根霉液态发酵产木聚糖酶的培养基进行优化研究.采用单因素实验,得到最佳的碳源、氮源、无机盐.采用Plackett-Burman对影响匍枝根霉产木聚糖酶发酵的相关因素进行评价,确定有显著效应的3个因素.采用最陡爬坡实验确定接近响应值区域显著因素的浓度,利用3因素3水平的Box-Behnken实验进行培养基优化.结果表明,培养基组成:3.9%麦麸玉米芯粉混合碳源,0.35%(NH4)2SO4,0.2%KH2PO4,0.2%MgSO4·7H2O,0.4%CaCl2,0.06%吐温-80,1%微量元素液,装液量为100mL,pH自然,接种量为10%,在30℃,180r/min条件下培养,其木聚糖酶酶活达到最高为101.697U/mL,比优化前木聚糖酶酶活提高了3.5倍.

匍枝根霉cbh2基因的克隆表达与结构分析

采用反向PCR技术从匍枝根霉中克隆cbh2基因,该基因编码440个氨基酸的蛋白质。利用DS2.5软件进行同源模拟和建立分子动力学模型,研究cbh2催化纤维六糖水解过程中结合区（CBM）上的关键位点,催化区（CD）上催化隧道关键位点的相互依赖作用,水解β-1,4糖苷键,生成纤维二糖。把cbh2基因与p ET22-b（＋）载体连接,实现了在E.coli BL21（DE3）中原核表达。通过镍柱层析、DEAE FF层析和G-75层析三步纯化法获得46 k Da的酶蛋白,比活力为4.67 IU/mg。纯化的重组酶具有高水平的催化活性,对微晶纤维素具有较好的水解特性,CBHII酶的Km为7.358（mg/m L）。研究CBHII酶的基本特性,其最适反应温度为50℃,最适反应p H为5.0,CBHII酶在p H 4～7下具有较宽的稳定性,在65℃以下热稳定性较好,在催化过程中保持较高的活力。

不同N端序列长度匍枝根霉△6-脂肪酸脱氢酶重组子的表达

克隆并在酵母中表达两个不同N段序列长度的匍枝根霉△6-脂肪酸脱氢酶重组子,其中长序列的重组子LYRnD6D是从匍枝根霉中克隆的△6-脂肪酸脱氢酶基因,编码459个氨基酸,N端序列为MSTLDRQSIFTIKELESISQRIHDG-DEEAMKFIII;短序列重组子SYRnD6D是预测的匍枝根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的ORF序列,N端序列为MKFIIIDKKVY,编码430个氨基酸;两个重组子均具有△6-脂肪酸脱氢酶保守的组氨酸序列和HPGG序列,长序列的N端比短序列长29个氨基酸残基(MSTLDRQSIFTIKELESISQRIHDGDE-EA)。两个重组子在缺陷型酵母中均得到了的表达,产生了γ-亚麻酸。利用酶的相对活力比较两个重组子在同一温度下的稳定性,长序列重组子的酶在15℃下反应4h后相对活力仍有74%,而短序列酶的相对活力只有43%,所以长序列重组子酶在低温下比短序列酶稳定性高,是因为长序列多出的氨基酸序列增加了酶的稳定性。

匍枝根霉内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的克隆及表达

从匍枝根霉TP-02的cDNA文库中克隆得到其内切葡聚糖酶基因,并在毕赤酵母中进行表达.该内切葡聚糖酶基因大小为954bp,将其与pPIC9K质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,利用T4连接酶进行连接.将线性化后的重组质粒转化毕赤酵母GS115,并利用MD平板和刚果红平板进行筛选.阳性克隆经甲醇诱导培养84h后,产生的内切葡聚糖酶酶活力达到峰值为1.754IU/mL.

匍枝根霉淀粉发酵产纤维素酶的条件研究

以匍枝根霉TP-02(Rhizopus stolonifer TP-02)为出发菌株,首次利用淀粉水解液为主要碳源,快速合成纤维素酶。从碳源、氮源、培养温度、初始p H、装液量和接种量等方面研究该菌株的产酶条件。获得最佳培养基和培养条件为:10%淀粉水解液,麸皮浸出汁5%,NH_4Cl 0.5%,KH_2PO_40.5%,MgSO_4·7H_2O 0.4%,CaCl_20.4%,酵母粉0.6%;发酵温度30℃,装液量80 m L/(250 m L),初始p H 5.0,接种量8%。通过摇瓶实验优化培养基和培养条件后,获得滤纸酶活为9.66 IU/m L。研究中进一步利用该培养基在5 L发酵罐中发酵至60 h时酶活达到最大值,其中滤纸酶活、外切酶活、内切酶活和β-葡萄糖苷酶分别为16.51、15.39、11.48和6.17 IU/m L。与以往纤维素类物质为碳源发酵产纤维素酶相比,淀粉水解液发酵获得的纤维素酶酶系组成有了较大的变化,特别是关键的外切酶活有了大幅度提高,而发酵时间缩短了将近1倍。

匍枝根霉β-葡萄糖苷酶BGLIII关键位点的结构功能

从匍枝根霉TP-02(Rhizopus stolonifer)基因组DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶bgl3全长基因,并在大肠杆菌BL21中实现表达。通过对β-葡萄糖苷酶的生物信息学分析,确定其与底物作用过程中的关键氨基酸为Trp127。对该位点进行突变研究,结果显示:突变为不带侧链的Ala时,酶活降低20.8%;突变为具有相同苯环侧链的Phe时,酶活相差不大;突变为带有非苯环长链的Leu时,酶活提高34.07%。Leu的长链在维持原有活性中心构象的基础上,与酶解产物葡萄糖的疏水作用增强,从而提高酶与底物结合效率。即127位氨基酸的空间构象对BGLIII活性中心的结构功能有显著影响。

高质量匍枝根霉cDNA文库的构建及鉴定

从匍枝根霉总RNA出发纯化获得mRNA,经逆转录酶作用合成cDNA,构建高质量的cDNA文库,为快速筛选和研究匍枝根霉相关关键基因提供了基础.研究采用CHROM SPIN柱回收大于500bp的cDNA并连接pUCm-T载体,成功构建了匍枝根霉cDNA文库.鉴定结果显示：文库库容为1.95×10^6 cfu,文库滴度为7.84×10^6 cfu/mL,该文库中cDNA片段大小分布在500~4 000bp,文库重组率为96%.

ARTP诱变筛选匍枝根霉提高木聚糖酶活力研究

以匍枝根霉亚种点头根霉TP-02为原始菌株,利用ARTP诱变系统进行诱变处理.通过透明圈法进行初筛和摇瓶发酵进行复筛,获得一株遗传性状稳定的高产木聚糖酶诱变菌株TZD-01,木聚糖酶活力达到280.81U/mL,为原始菌株的2.7倍.通过光学显微镜和扫描电子显微镜观察诱变菌株与原始菌株微结构特征变化,ARTP诱变处理可引起菌株形态特征发生改变.诱变菌株的菌落形态不规则,颜色为黑褐色,比原始菌株偏深;菌丝直径变大,形态更饱满;孢子形态规则更接近圆形,诱变筛选菌株的生长速度比原始菌株更快.

匍枝根霉组成型内切葡聚糖酶基因的筛选和表达

从匍枝根霉cDNA文库中筛选得到组成型内切葡聚糖酶基因(zeg1和zeg2),经比对zeg1和zeg2相似度为86%,有相似的催化活性区域,经CDD(保守序列数据库)分析,该蛋白归属于糖苷水解酶第5家族,对比PDB(蛋白结构数据库)中第五家族的关键催化残基,预测该两个蛋白的第147位的谷氨酸(E)及199位的色氨酸(W)为该蛋白的关键催化残基。重组zeg1发酵至20 h时达到最高酶活为0.422 IU/mL;重组zeg2发酵至24 h达到最高酶活为0.509 IU/mL。酶学性质研究表明重组zeg1和zeg2的最适温度均为50℃,最适pH值均为5.0。通过CMC-SDSPAGE电泳,复性后染色,测得重组zeg1和zeg2的分子量分别约为55 kD和58 kD。