基于转录组测序与定量PCR技术挖掘北沙柳株型相关候选基因

为构建北沙柳株型分子辅助育种体系实现高效定向育种,采用水培群体转录组测序与野外训练群体定量PCR分析相结合的方法,以RNA-Seq分析中的基因表达量(FPKM值)与冠高比(株型特征值)的相关系数作为预测值,探讨北沙柳株型相关候选基因挖掘技术。结果表明,北沙柳冠高比与FPKM值间存在相关性,在水培预测群体和野外训练群体中保持基本一致的趋势。文献中已报道的株型(或者分枝)相关基因(TAC 2、LAZY 1b、ZFP 4、TB 1、SPA 2、ABF 2和PYL 1)的预测值在0~0.6,ATX 1、RFK 1和FHY 1基因(未报道与株型相关)的预测值较高(0.6~1.0),按照“基因个数最少,相关系数最高”的原则,选择双基因组合ATX1+FHY 1作为鉴别北沙柳株形的基因。将形态学、转录组学作为一个整体来挖掘株型性状相关基因是本研究特色,研究结果也可为其他植物、其他性状的分子辅助育种提供理论基础。

北沙柳株型候选基因表达量与株型相关性的验证

[目的]构建北沙柳株型MAS体系实现高效定向育种。[方法]以不同株型北沙柳作为研究材料,构建预测群体、训练群体及验证群体。采用RNA⁃seq与RT⁃qPCR分析相结合的方法,以测序结果中FPKM值与北沙柳冠高比的相关系数作为预测值,并在大群体和不同时间采样群体中进行验证,最后通过基因组合法筛选与株型相关的最佳基因组合,探讨了北沙柳株型候选基因挖掘技术。[结果]冠高比是体现株型性状较理想的特征值。RNA⁃seq结果中不同基因的预测值不同,预测值的变化范围是0.0~0.9。目标基因(选择已验证与分枝有关SpsLAZY1b、SpsTAC2基因,与调控株型有关的差异基因ZFP4、TB1、SPA2、ABF2、PYL1以及预测值较大的ATX1、FHY1、RFK1基因作为目标基因)表达量与冠高比的相关性在预测群体、训练群体以及验证群体中具有相同的变化趋势,且ATX1、FHY1、RFK1在训练群体和验证群体中相关系数较高。按照“基因个数最少,相关系数最高”的原则,选择(ATX1+FHY1)为鉴别北沙柳株型的最佳基因组合。[结论]可利用RNA⁃seq结果筛选北沙柳株型候选基因,基因表达量与目标性状相关系数越高,功能基因与性状的关系越密切,且水培实验不会改变北沙柳的株型。将形态学、转录组学作为一个整体来挖掘株型性状相关基因是本研究特色,利用性状与相关基因建立北沙柳株型后备基因的筛选是本研究的创新之处。研究结果也可为其他植物、其它性状的MAS提供理论基础。

北沙柳种质资源居群表型多样性

该研究采用单因素方差分析、巢式方差分析、群落多样性指数分析等方法,以国家北沙柳种质资源库内13个居群的494个无性系为实验材料,通过表型性状(叶面积、叶周长、叶柄长、叶长、叶宽、长宽比、开枝角度、株高和地径)比较分析,探讨居群间和居群内表型分化程度、表型多样性和地理变异,为北沙柳种质资源遗传改良和生产提供理论依据。结果显示:(1)北沙柳表型性状变异丰富,变异系数范围为17.64%~28.79%,平均为22.53%。(2)在13个居群中,居群P2的Simpson、Shannon和Brilliouin平均多样性指数最高,居群P13最低;表型性状中分枝角度多样性指数最大,地径多样性指数最小。(3)表型性状分化系数为0.265 4,即北沙柳种质资源居群间表型变异为26.54%,居群内表型变异为73.46%。(4)主成分分析表明,叶面积、叶周长、叶长、叶柄长和叶宽对分组的贡献率较大;聚类分析将13个北沙柳居群可划分为四组;Mantel检验表明,地理距离与表型距离(欧氏距离)相关性不显著(r=0.192 3,P=0.082)。研究认为,居群内不同无性系的选育是北沙柳定向育种的主要研究方向;边缘居群的表型性状具有形成地理变异的趋势;遗传多样性高是北沙柳适应性强的物质基础。

北沙柳群体遗传多样性和遗传结构分析

以内蒙古北沙柳(Salix psammophila)国家种质资源库内9个群体(P1~P9)288个无性系为实验材料,利用TP-M13-SSR技术,选取22对具有多态性EST-SSR北沙柳引物,采用毛细管电泳对PCR产物进行检测,分析北沙柳遗传多样性、分化程度和群体遗传结构,为北沙柳种质资源库遗传管理、无性系鉴定、品种选育、遗传改良和构建指纹图谱提供理论依据。结果显示:(1)22对EST-SSR引物共检测到222个等位基因,各位点平均等位基因数(A)为10,四倍体基因型丰富度(G)和特异基因型(G1)总和分别为1 460和802个,平均特异基因型比率(P1)和种质鉴别率(P2)分别为45.86%和13.21%。(2)9个群体平均等位基因数(A)为7.475,基因型丰富度(G)为15.586,观察杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.577和0.638。以期望杂合度He为标准,北沙柳群体遗传多样性水平最低的是P1和P9。(3)北沙柳群体遗传分化系数仅为0.02,AMOVA分子变异分析显示,北沙柳群体大部分遗传变异来自群体内(97%),群体间变异仅为3%。(4)三维主成分、聚类和Structure群体遗传结构分析显示,9个群体被划分为2个组,Mantel检验表明北沙柳遗传距离与地理距离极显著相关(r=0.684 P<0.001)。研究表明,北沙柳种质资源具有丰富的遗传多样性,这是其具有耐旱、耐寒、耐高温、耐沙埋和抗风蚀等适应性较强的分子基础;北沙柳的遗传变异集中在群体内;分布区群体呈现由中心向边缘群体扩张分化的趋势。

北沙柳种质资源的初步调查与分析

为了解我国毛乌素沙地北沙柳种质资源的生长状况以及北沙柳部分性状的分类和分布规律,对北沙柳种质资源进行科学的管理以及有效的利用,采用样线法与随机抽样相结合的调查方法,对我国毛乌素沙地北沙柳的生长发育状况进行现地调查,确定了我国北沙柳的主要分布区。采用数理统计的分析方法分析了北沙柳部分性状的变异情况及其生长现状。(1)北沙柳灌丛高度和冠幅均符合正态分布,冠幅变异幅度大于灌丛高度变异幅度。(2)不同种源区北沙柳灌丛高度差异显著,冠幅差异不显著。(3)不同种源区北沙柳的扦插成活率差别较大。

毛乌素沙地北沙柳形态特征与花序分布习性研究

采用随机抽样法，对毛乌素沙地鄂尔多斯市乌审旗图克乡境内的北沙柳株丛的形态特征和花序数量进行了调查分析，以明确北沙柳的形态特征及其花序分布习性。结果显示：北沙柳树冠最大横截面积在5～10m^2的株丛最多，占总株丛数的40％，频率呈现偏左正态分布。北沙柳株高、近地直径和枝条长度频率均呈现正态分布；80％以上的株丛其花序数量小于3万个，频率呈现偏左正态分布；株丛树冠最大截面积与花序数量的相关系数为0．588（P〈0．05）；着生花序枝段长度与花序数量间的相关系数为0．355（P〈0．05）；2年和3年生萌蘖枝数平均花序数量分别为92个和138个。研究表明，花序数量主要取决于株丛最大横截面积、2年和3年生萌蘖枝数量以及着生花序枝段长度；生产中平茬周期以4年为宜，雌雄树比例应为1：0．75。

北沙柳种质资源信息管理系统的建设

本文论述了"北沙柳种质资源信息管理系统(Salix psammophila Germplasm Resources Management Information System)"的设计思想、程序结构及应用效果,根据北沙柳种质资源库信息管理的需求,将Access数据库技术应用于北沙柳种质资源库管理中。该系统的开发目的在于对该类种质资源库的信息进行合理的管理,让用户能够科学、有效地使用种质资源库中的信息。该系统的应用,不仅减轻了工作人员的劳动强度,而且使各种资料得到充分共享,加快信息提取及信息汇总速度,提高了工作效率。

^(60)Coγ射线对北沙柳(Salix psammophila)的辐射效应

本试验分别剪取处于休眠和萌动两种状态的一年生和二年生北沙柳枝条，用６０Ｃｏγ射线照射，照射后分别在室内和室外按随机区组配置。室内水培，室外扦插繁殖，定期对花芽的发育、插条的成活率、田间成株率及萌芽生长进行观测和分析，研究γ射线对北沙柳的辐射效应。

毛乌素沙地北沙柳人工林生态系统服务及其损益分析

以毛乌素沙地不同林龄的北沙柳人工林为研究对象,在收集、实测不同林龄生态系统服务数据的基础上,分析其变化特征,并通过ESCI指数刻画其损益情况。结果表明:随着林龄的增加,除了速效磷和速效钾先增加后减小外,丰富度指数、Simpson指数、Shannon-Wiener指数、单位面积地上生物量、土壤有机质、全氮和土壤含水量均表现出增加的趋势,防风固沙能力也在增强。随着林龄的增加,生态系统服务增益显著,生物多样性和固碳调节在0~8 a林龄段增益最快,ESCI分别可达8.82和28.50;土壤肥力调节在8~14 a林龄段增益最快;涵养水源在造林初期并没有显著减损;防风固沙在造林初期增益显著,并在造林23 a后防风固沙功能较为稳固。与黑沙蒿群落相比,北沙柳人工林生物多样性和固碳调节在造林8 a后就已经处于增益状态,土壤肥力调节在造林14 a后处于增益状态,所有的功能在造林34 a后均增益。建议今后北沙柳应在该地区人工林营建中继续应用。

北沙柳及几种柳树过氧化物酶同功酶遗传变异的研究

采用聚丙烯酰胺垂直电泳技术对北沙柳及其它柳树进行过氧化物酶同功酶遗传变异的研究。结果表明：试材共有酶带２５条，基本酶带９条，变异带１６条，其中有１条酶带为试材所共有。在沙柳无性系中最多的有１３条带，最少的４条带。从酶谱图中可知，按染色程度可划分为３个区，从负极到正极依次为Ａ、Ｂ、Ｃ三区。可假定分属为３个基因位点控制，。每个位点从分子水平讲，含有多个座位亦即多个等位基因，从而表现了过氧化物酶同功酶的多态性。同一无性系的同株或不同株酶谱相同再现性或重复性强；不同无性系酶带、酶谱明显变异；种间酶谱类型差异明显。

北沙柳机械打孔深栽抗旱造林技术初探

为解决干旱沙漠区因造林成活率低导致造林补植比重大、造林成本增加、影响林分质量提高等问题，就主要造林树种北沙柳机械打孔深栽抗旱造林技术进行了试验研究。结果表明，该技术具有造林成活率和劳动效率高、不需专门整地、简单实用等优点，其造林成活率较常规人工挖坑造林提高23．5％～42．8％；劳动效率是人工挖坑造林的2．67～3．78倍，适宜于在沙区灌木造林中推广使用。

基于cpDNA非编码序列的北沙柳遗传多样性分析

为揭示北沙柳(Salix psammophila)的遗传多样性、遗传结构及分化特征,利用叶绿体非编码区序列(trnL-trnF和trnD-trnT)对分布于毛乌素沙地和库布齐沙漠的16个北沙柳居群(339个个体)进行了遗传研究,为北沙柳种子资源库遗传管理、遗传改良、遗传育种及品种选育提供理论依据。结果表明:(1)经trnL-trnF和trnD-trnT片段联合比对获得了1811 bp序列,共有12个核苷酸变异位点(8个简约信息位点,4个变异位点),得到16个单倍型。(2)单倍型多样性指数(Hd)为0.737,核苷酸多样性指数(π)为0.00107;且单倍型H3的分布在所有居群中位于单倍型网络图中心,其余单倍型随机分布于各个居群。(3)AMOVA分析表明,北沙柳cpDNA的变异主要来源于居群内(91.16%),居群间遗传分化程度中等(FST=0.08837),各居群间的基因交流非常频繁(Nm=2.58);遗传分化系数NST(0.085)显著大于GST(0.056,0.01<P<0.05),表明北沙柳居群具有明显的分子谱系地理结构。(4)中性检验及失配分析表明,北沙柳居群分布范围没有发生明显扩张的痕迹。

基于最大熵模型(MaxEnt)预测北沙柳潜在地理分布

为确定北沙柳在我国的适生情况,本研究将北沙柳地理分布信息与6个气候因子基于最大熵模型(MaxEnt)对其潜在分布进行模拟预测。AUC值大于0.9,表明预测结果良好;影响北沙柳分布主导环境因子有年平均温度、温度季节变化、海拔、最湿月降水量、昼夜温差与年温差比值、最干月降水量、昼夜温差月均值;计算出北沙柳在我国的存在概率,DIVA-GIS自动划分为4个等级,分别为不适应生境(p<0.07)、低度适应生境(0.07≤p<0.24)、中度适应生境(0.24≤p<0.49)、高度适应生境(0.49≤p<0.95);当前时期到未来(2050年)时期4个情景(RCP 2.6、RCP 4.5、RCP 6.0、RCP 8.5)下的适生区面积均有所增加。模型预测结果显示,北沙柳适生区主要集中在鄂尔多斯市和榆林市交汇处、中卫市与阿拉善左旗交汇处。结合北沙柳的实际地理分布信息与基于MaxEnt模型预测的当前时期的潜在分布基本吻合,表明MaxEnt模型对北沙柳的潜在生境概率预测可靠,得出的结果对北沙柳的推广与引种具有一定参考价值。

不同处理对北沙柳扦插繁殖的影响研究

通过不同扦插基质和不同浓度生根粉溶液处理对北沙柳扦插繁殖的影响试验研究。结果表明:河沙作为育苗基质对于北沙柳的育苗效果最好,园土次之,混合基质(园土∶草炭=1∶1)最差;不同浓度的生根粉溶液处理对北沙柳的育苗效果没有影响。

干旱胁迫对不同种源北沙柳幼苗生长特性的影响

对7个种源的北沙柳1年生幼苗开展干旱胁迫试验的结果表明,各种源表现出的胁迫症状基本相同,随着胁迫水平的增加,产生的胁迫症状越严重。干旱胁迫使北沙柳的生长受到抑制,株高与基径的生长减缓,总生物量的积累受到抑制。干旱胁迫促进北沙柳根系的生长,以吸收更多的水和营养,从而提高其抗旱性,综合分析可知宁夏盐池种源(SNY)是干旱胁迫下生长表现最优的种源。

北沙柳根系损伤对光合特性的影响

以1~2年生北沙柳为试验对象,研究自然条件下北沙柳根系受不同程度损伤后叶片净光合速率、气孔导度、蒸腾速率和叶绿素含量的变化趋势。结果表明:北沙柳根系受损后1 d,叶片净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和叶绿素含量与对照相比均发生下降,其中轻度损伤各指标分别下降30.82%、78.21%、68.88%、0.86%,中度损伤下降46.16%、85.44%、78.09%、12.72%,重度损伤下降69.50%、91.85%、87.16%、35.16%,北沙柳根系受损程度越大,各项指标数值越低。与第1 d相比,根系受损后第9 d的叶片净光合速率、蒸腾速率、气孔导度数值上升,轻度损伤分别上升44.01%、34.38%、3.91%,中度损伤分别上升35.87%、76.01%、20.59%,重度损伤分别上升101.26%、135.87%、60.65%,而轻、中、重度损伤,其叶片叶绿素含量分别降低19.37%、13.51%、16.71%。北沙柳根系受损后,各项指标在1~9 d内均呈先上升、后下降趋势。短期内北沙柳的各项指标无法恢复到正常水平。

西藏阿里地区北沙柳引种栽培适应性分析

西藏阿里地区是陕西省对口援藏地区。为解决阿里地区荒漠化防治中可利用灌草资源相对短缺的问题,借鉴陕西榆林沙区北沙柳(Salix psammophila)治沙方法,于2015-2018年在狮泉河镇开展北沙柳引种栽培试验。结果表明:狮泉河镇北沙柳6月中旬开始展叶、6月下旬完全展叶、9月上旬开始落叶,约比榆林沙区晚2个月展叶、早1个月开始落叶,生长期短3个月;北沙柳在阿里地区生长的主要限制因子为气温与相对湿度,生长量与气温、相对湿度呈正相关关系,而与气压呈负相关关系;生长3年后,狮泉河镇北沙柳较榆林沙区平均叶长小49.74%、平均地径小41.48%、整株高度低52.91%、枝条长度小83.62%,东西冠幅小2.68倍,南北冠幅小1.71倍,各生长指标均显著低于榆林沙区;北沙柳在狮泉河镇与榆林沙区的成活率分别为95%和98%,2年平均保存率分别为89%和94.5%,差异均不明显。引种栽培的北沙柳在阿里地区具有一定的适应性,可进行进一步扩繁试验和适度的推广。

荒漠北沙柳根系丛枝菌根真菌和黑隔内生真菌定殖状况

为利用土壤共生真菌资源促进荒漠植被恢复和生态重建,分别于2013年6月、8月和10月,从内蒙古元上都地区采集北沙柳(Salix psammophila)根围0–10、10–20、20–30、30–40和40–50 cm共5个土层的土壤样品,系统研究了丛枝菌根真菌(AMF)和黑隔内生真菌(DSE)的时空分布及其与土壤因子的相关性。结果表明:AMF和DSE的平均定殖率分别为77%和84%,说明北沙柳根系能与这两类真菌形成良好的共生关系。AMF和DSE的分布和定殖具有明显的时空异质性,并与土壤因子密切相关。AMF和DSE的平均定殖率均表现为10月>8月>6月。土壤深度对AMF和DSE的定殖率有显著影响,AMF和DSE定殖率的最大值分别在0–20 cm和0–10 cm土层。双因子方差分析表明,月份和土层对AMF和DSE的定殖率以及土壤因子具有显著的交互效应。主成分分析表明,土壤湿度、pH值、碱性磷酸酶、易提取球囊霉素是内蒙古荒漠环境中AMF和DSE定殖的主要影响因子。

北沙柳居群间叶片性状的变异

采用方差分析、相关分析、聚类分析的方法,对国家北沙柳种质资源保存库内收集的21个居群叶片表型性状进行了比较分析。结果表明:1)相同表型性状在不同居群内也存在差异,所有性状的平均变异系数最大和最小的分别是P5(0.3864)和P21(0.1664),表型性状中变异最大和最小的分别是叶面积(0.3549)和异形指数(0.1221)。2)相关分析表明,叶面积、周长、叶柄长、叶长和叶宽之间均为极显著相关(P=0.01),长宽比和异形指数与各表型性状相关性不显著。3)聚类分析表明,P21明显分割于其他居群外,表现出特异性。叶片性状变异特征为北沙柳优良品种筛选提供了科学依据。

北沙柳SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

以TIANGEN试剂盒法提取北沙柳嫩叶的DNA为模板,利用柳属和杨属的SSR引物,建立了北沙柳SSRPCR反应体系,对反应体系中影响聚合酶链式反应(PCR)的因素进行了优化。结果表明,在25μl的PCR反应体系中,DNA模板用量为40ng,TaqDNA聚合酶0.05U/μl,10×PCR buffer(含Mg2+)2.5mM,dNTP 0.25mM,SSR引物0.5μM,加ddH2O补足至25μl时结果最好。利用该体系初步筛选出30对适合北沙柳SSR扩增的引物,并采用优化筛选出的12对引物对9个产地的270个北沙柳无性系进行PCR扩增,多态位点百分率达到90.4%,表明柳属和杨属的SSR引物可以在北沙柳上应用。