北里链霉菌(Streptomyces kitasatoensis 2488)启动子和柱晶白霉素抗性基因的克隆

用启动子探针质粒pIJ486作载体,变青链霉菌TK24作受体,克隆来自北里链霉菌SK2488的启动子和柱晶白霉素抗性基因,得到三个转化子其中转化子变青链霉菌TK24(pRL1)中重组质粒插入片段约为10kb,其外源启动活性和柱晶白霉素抗性较低;转化子变青链霉菌TK24(pRL2)中重组质粒插入片段较小,但具有高活性的外源启动子,并有较高的柱晶白霉素抗性;转化子变青链霉菌TK24(pRLX)中未分离得到重组质粒,但它同样具有区别于受体的对新霉素和柱晶白霉素的抗性,而且它在R_2YE平板上能抑制其它转化子生长,其发酵液经薄层层分析发现有不同于供体和受体的新斑点,发酵液经高压液相分析发现有一个吸收峰。但三个转化株发酵液均无抗菌活性,将重组质粒pRL1和pRL2再转化变青链霉菌TK24,抗性稳定。

生米卡链霉菌DNA对北里链霉菌原生质体种间转化

采用SDS-苯酚法提取生米卡链霉菌DNA,同时以SDS处理生米卡链霉菌原生质体得到游离DNA。将提取DNA及游离DNA转化北里链霉菌原生质体,得到10^(-2)的转化率。转化子经发酵得柱晶白霉素,其产量比亲本高5.2倍,同时发现组份亦有所变化,A_5组份从9.1％提高到36.7％。

柱晶白霉素的研究(Ⅱ)——北里链霉菌耐前体类似物耐柱晶白霉素高产菌株的筛选

柱晶白霉素(Leucomycin简称LM)的结构如图1所示,其中组分A_1、A_3的R_2侧链为异戊酰基,来自前体亮氨酸。在柱晶白霉素的生物合成过程中,存在着菌体自身产物和产物前体的反馈抑制作用。解除这些反馈抑制,就会提高抗生素的产量。本实验采用耐自身产物和耐前体类似物的复合筛选方法,筛选北里链霉菌的高产菌株。自身产物为柱晶白霉素,耐受剂量为4000u/ml,产物前体为亮氨酸(Leucine),前体类似物为4-氮杂亮氨酸和2-噻唑丙氨酸。

添加甘油对北里链霉菌ZY150504发酵生产吉他霉素的影响

本文研究了添加甘油对北里链霉菌ZY150504发酵吉他霉素效价和A5组分的影响。考察了甘油的添加浓度和添加时间对发酵液效价的影响,发现通过添加甘油,提高发酵培养基中的起始甘油浓度,有效地提高了吉他霉素的效价。发酵结束时发酵液的效价为10847U/m L,比对照提高了47%,比文献报道效价提高了27%;吉他霉素A5组分含量提高17%;而A4组分含量降低了36%。进一步研究发酵过程发现添加甘油之后,发酵过程中条件组的脂肪酶活力较高,油脂利用较快,丙酸含量增加,乙酸浓度较低,促进了吉他霉素的生物合成,提高了A5组分的含量。

重离子束对北里链霉菌的诱变效应

考察不同剂量重离子束对北里链霉菌的致死及诱变效应,可确定最有利于筛选高产菌株的重离子束辐照剂量。利用不同剂量的重离子束辐照北里链霉菌孢子,统计了存活率、致死率、正负突变率。结果发现,在5 Gy重离子辐照时北里链霉菌出现较高致死率,其后随剂量升高,致死率变化较平缓。各辐照剂量下正负突变率相比较,40 Gy时正突变率最高,负突变率相对较低,存活率为0.92%。因此确定40 Gy是对北里链霉菌高产菌株筛选最有利的辐照剂量。

吉他霉素高产菌株的选育

以吉他霉素产生菌Ｒ－０１－１０５菌株为出发菌株，经紫外线、Ｃｏ６０、色氨酸、异亮氨酸和２－ＤＯＧ复合处理，获得４株高产突变株，其中Ｔ－１１－１２０的摇瓶效价（１５３０２ｕ／ｍｌ）比出发菌株（８５００ｕ／ｍｌ）提高８０．１％，在１０吨发酵罐上连续８批验证，平均发酵效价１２３８８ｕ／ｍｌ，比原生产水平（７４００ｕ／ｍｌ）提高６７．４％，并且质检全部合格。

柱晶白霉素产生菌的选育──耐磷高产突变株的分离

柱晶白霉素产生菌──北里链霉菌（Ｓｔｒｅｐｏｍｙｃｅｓ．Ｋｉｔａｓａｔｏｎｅｓｉｓ），通过紫外线处理和高浓度磷酸盐平板上选择分离到突变株ＵＤＰ１－２，在正常发酵培养基条件下摇瓶发酵柱晶白霉素超产可达１８．６％。而且变株的菌落形态与亲本菌株差异较大。

吉他霉素生产菌培养条件优化

研究淀粉、豆饼粉及丝素粉等3个培养基主要成分对吉他霉素生产菌北里链霉菌发酵结果的影响,同时考察种龄及前体添加对效价的影响。对3个培养基成分采用三因素三水平正交实验设计,对种龄及前体物质则采用梯度实验。最后得到一个相对最优的北里链霉菌培养条件。