牛腺病毒3型感染状况及其fiber轴区基因检测

本研究旨在通过TB Green Real-time PCR的方法对国内6个省(四川省、山西省、河南省、河北省、江苏省和内蒙古自治区)的9个规模化养牛场140份以流鼻涕、发热、咳嗽、呼吸困难为特征的病牛呼吸道鼻拭子样本开展牛腺病毒3型(bovine adenovirus type 3,BAdV-3)感染状况调查,并对其中的阳性样本进行fiber轴区基因检测。结果显示,140份样品中BAdV-3阳性率为36.4%,除河北省以外,其余各省均有BAdV-3检出,其中,四川及河南省检出率最高,分别达到82.9%(29/35)和83.3%(10/12)。其中,传统型占总阳性比的80.4%,fiber轴区缺失毒株占总阳性样本的19.6%。缺失位置与数量一致,轴区连续缺失237个碱基对(79个氨基酸),且缺失型仅在四川和河南两省检出,检出率分别为24.1%(7/29)和30%(3/10),场群阳性率分别为100%(2/2)和100%(1/1)。结果表明,BAdV-3已在我国牛场中广泛分布,目前流行的主要以传统型毒株为主,fiber轴区缺失毒株在我国具有独特的地域分布,主要在四川和河南省流行。

戊型肝炎病毒结构区基因在大肠杆菌中的表达及其在诊断中的应用

利用融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ表达了戊型肝炎病毒第二（ＯＲＦ２）和第三读码框（ＯＲＦ３）区的两个抗原表位，并利用ＯＲＦ２表位上游自然存在的限制性内切酶位点和ＯＲＦ３下游通过ＰＣＲ引入的限制性内切酶位点，使两个免疫表位区域形成嵌合。表达的三种抗原均溶于水。可利用商品化的谷胱甘肽－４Ｂ亲合层析柱得到纯化的抗原。经试用发现，基因重组抗原作为酶联免疫试剂的抗原用于检测血清中抗戊型肝炎病毒抗体，与新加坡进口试剂盒有高度的一致性。

抗人肺腺癌单克隆抗体重、轻链可变区基因的分离克隆和序列测定

根据鼠免疫球蛋白重。轻链可变区基因ＦＲ１和ＦＲ４的序列保守性，化学合成了适于体外扩增Ｉｇ重、轻链可变区基因（Ｖ_Ｈ和Ｖ_Ｌ）的数对引物。以分泌抗人肺腺癌单抗的杂交瘤细胞株ＷＬＡ－２Ｃ４的基因组ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增Ｖ_Ｈ和Ｖ_Ｌ基因，分别克隆人ｐＵＣ１９载体。转化子经蓝、白斑筛选，酶切鉴定，双脱氧测序证实确为鼠单抗可变区基因，其中Ｖ_Ｈ基因全长为３４８ｂｐ，编码１１６ａａ，属重链ⅡＢ亚类；Ｖ_Ｌ基因全长３１８ｂｐ，编码１０６ａａ，属Ｋ轻链Ⅵ亚类。

旋毛虫ITSⅡ区基因的克隆及其在分类学上的应用

克隆了6个不同旋毛虫隔离种的核糖体RNA ITSⅡ区的基因片段,序列分析结果表明,黑龙江省猪旋毛虫和猫旋毛虫为旋毛形线虫(Trichinella spiralis);犬旋毛虫为本地毛形线虫(Trichinella nativa),与传统的分类结果基本一致,为传统的分类学方法提供了基础依据。

金黄色葡萄球菌凝聚因子A区基因的克隆表达及表达产物的免疫学特性

采用PCR技术对引起乳牛乳腺炎的金黄色葡萄球菌凝聚因子(ClfA)A区基因进行了扩增和克隆测序,并对测序结果用DNAStar软件进行了抗原表位分析,成功构建了原核表达质粒pET-32a-ClfA A。将其转入宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,证实目的蛋白以可溶形式存在。用His.Bind柱对其纯化后获得了纯度较高的蛋白。纯化后的蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫家兔得到了较高效价的抗血清,通过ELISA、试管凝集试验、吞噬调理试验、抗体抗金黄色葡萄球菌黏附能力检测等对表达产物及制备的超免疫血清进行了检测。试验证明目的蛋白具有黏附活性,自制的超免疫血清具有抗金黄色葡萄球菌黏附至牛纤维蛋白原的作用以及吞噬调理作用,所表达的蛋白为ClfA A蛋白。

381例HBV感染者HBV DNA前C区基因突变的研究

目的 :研究乙肝病毒前C区基因变异株感染在乙肝病毒感染者中的分布情况 ,探讨其临床意义。方法 :采用PCR -SSCP分析技术对 381例HBV感染者进行HBVDNA前C区基因突变检测。结果 :在不同临床类型的感染者中 ,检出率以肝癌患者最高 (6 6 .7% ) ,其次为慢重肝 (5 0 .0 0 % )、肝硬化 (43 .75 % )和慢性肝炎 (35 .35 % ) ,它们与无症状HBV感染者和急性肝炎患者比较 ,差异均有显著性 (P <0 .0 5 ) ;在ALT明显升高的患者中 ,前C突变的检出率 (34.86 % )明显高于ALT正常者 (2 1.71% )。结论 :HBVDNA前C区基因突变可能与乙型肝炎病变的病程和严重程度有关 ;SSCP方法是检测HBVDNA前C区基因突变较为简便、快速、经济的方法 。

抗人CD16单克隆抗体可变区基因的克隆和表达

目的 克隆抗人CD16单克隆抗体重、轻链可变区（VH,VL）基因并合成单链抗体（ScFv）基因。方法 从分泌抗人CD16单克隆抗体的杂交瘤细胞B88-9中提取总RNA,应用RT-PCR技术获得抗CD16单克隆抗体的VH、VL基因。用连接肽（Linker）将VH和VL连接成具有VH-Linker-VL结构的ScFv基因,将其克隆到表达载体pcDNA3.1（+）,并转染COS-7细胞。结果VH基因长度为354bp,属于鼠抗体可变区重链基因家族I（B）亚群;VL基因长度为333bp,属于鼠抗体可变区 kappa轻链基因家族Ⅲ亚群。采用夹心ELISA方法检测到ScFv的表达。结论 抗人CD16单克隆抗体VH与VL基因的克隆和ScFv基因的构建为基于CD16的导向免疫治疗奠定了基础。

线粒体基因组D-Loop区基因多态性与2型糖尿病的相关性

随机选取199例浙江地区2型糖尿病患者与102例正常对照,采用聚合酶链反应(Polymerase chain re-action,PCR)、基因片段直接测序来检测线粒体基因组D-Loop区域基因变异情况,同时分析其与主要临床指标的关系。结果显示:线粒体基因组D-Loop区域为一高变异区,np73A-G、np263A-G、np16223C-T、np16519T-C为4个高变异位点;发现29个未见报道的新变异位点;np193A-G、np234A-G、np16108C-T等变异与糖尿病家族史有关。这表明浙江籍汉族人线粒体基因组D-Loop区存在大量基因多态性现象,此区域的某些变异可能与糖尿病的发生发展等具有一定相关性。

单、双子叶植物的代谢物调节农杆菌Vir区基因表达的研究

本文研究了六种植物(三种单子叶植物、三种双子叶植物)愈伤组织的渗出物和抽提物对农杆菌Vir基因表达的调节作用。其调节水平随植物的不同而明显不同,但单、双子叶植物的代谢物对Vir基因表达的调节作用并非截然分开。即使在双子叶植物(如大豆)的抽提物与渗出物中也存在着抑制Vir基因表达的因子,而在单子叶植物(如玉米等)的抽提物与渗出物中也存在着促进Vir基因表达的调节因子。Vir位点的调节反应随渗出物与抽提物的种类不同而明显不同,不同Vir位点对同类渗出物或抽提物的反应也不同。渗出物对Vir基因表达的正调节效应优于抽提物。植物渗出物与AS对Vir区基因表达的调节并不表现简单的累加效应或协同作用。相反,在渗出物中还存在着不同程度阻抑AS对Vir基因表达正调节的因子。

大连地区无偿献血者隐匿性乙型肝炎病毒感染pre-S/S区基因分析

目的了解大连地区无偿献血者隐匿性肝炎乙型病毒感染(OBI)的情况和pre-S/S区基因的变异情况。方法对大连市血液中心2010年12月2日-2013年5月31日的无偿献血者血液标本进行常规ELISA(HBs Ag、抗-HCV、抗-HIV和抗-TP)和HIV/HBV/HCV联合NAT筛查,对于单独核酸检测反应性的献血者加以跟踪或回溯,结合乙型肝炎血清学标志物的试验、鉴别试验、病毒定量试验和半巢式PCR来确定OBI,同时对OBI的pre-S/S区基因序列与对照组(HBs Ag+序列,Genbank)做比对分析。结果共筛查158 232份血液标本,确定了其中的69份OBI,流行率为1∶2 293(69/158 232)。41例OBI获得pre-S/S区基因序列:B型6例、C型34例、D型1例;与对照组相比,OBI在S区的氨基酸序列的变异明显(PB=0.013;PC=0.003),主要变异位点为B型的V14G/A、Y161F/S、V168A、P217L和C型的E2G/A/V、T118R/K/A/M、P127T/L/H/S、E164D/G、L175S、S174N。结论大连地区献血者OBI在HBV基因组S区的氨基酸序列存在多个位点的变异,这些变异与OBI的产生存在某种关系,且这种关系受基因型的影响。

鹅细小病毒VP1-VP3非重叠区基因的克隆与序列分析

通过克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)分离株VP1-VP3非重叠区基因,并对其进行序列分析,为鹅细小病毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断奠定理论基础。进行鹅胚病毒增殖,收集尿囊液,提取基因组,参考发表的B株序列,设计合成一对引物,经PCR扩增,克隆VP1-VP3基因,筛选阳性克隆,对其进行序列测定及同源性分析。结果表明,克隆的基因片段为901 bp,VP1-VP3基因共594 bp,编码198个氨基酸;弱毒株之间亲缘关系很近,核苷酸同源性99.5%～100%, 氨基酸同源性98.5%～100%; 强毒株与B株亲缘关系较近, 核苷酸同源性96.6%,氨基酸同源性97.5%;弱毒株与强毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性92%～93%,氨基酸同源性96%～97.5%;弱毒株与B株亲缘关系最远,核苷酸同源性92.5%～93%,氨基酸同源性93.9%～95.5%。说明强毒株与弱毒株之间核苷酸序列存在差异。

抗CEA抗体可变区基因的克隆及其嵌合抗体的表达

目的 在真核细胞中表达抗癌胚抗原 (carcinoembryonic antigen,CEA)人 -鼠嵌合抗体。方法 从分泌抗 CEA鼠单抗 C5 0的杂交瘤细胞中扩增、克隆可变区基因。测序鉴定后连入真核表达载体 ,导入二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢 (dihydrofolate reductase- deficient Chinese ham ster ovary,CHO- dhfr- )细胞进行表达。采用间接和竞争抑制 EL ISA检测表达产物的人源性和抗原结合特异性。结果 序列测定初步确定所克隆的是功能性抗体可变区基因。在转染细胞上清中测到抗 CEA嵌合抗体的表达。EL ISA试验证实该嵌合抗体具有人的恒定区 ,并与原鼠单抗 C5 0有相同的抗原结合特异性。结论 成功地在真核细胞中表达了抗 CEA人 -鼠嵌合抗体。

端粒酶反转录功能区基因的表达和纯化

通过PCR技术扩增出hTRT的目的片段,克隆至表达载体pET28 b中并转化至BL21(DE3),经IPTG诱导后在52kDa处发现有外源基因的表达,密度扫描显示表达蛋白含量为20%。目标蛋白以包含体形式存在,含8mol/L尿素和10mmol/LDTT的裂解缓冲液溶解的包含体采用金属螯合层析有效分离出目标蛋白。免疫印迹实验表明:诱导出的融合蛋白是端粒酶反转录功能区基因所编码的蛋白质。

绿脓杆菌PA-SD-1株外毒素AⅢ区基因的克隆及序列分析

利用PCR技术 ,以绿脓杆菌羊分离株 (暂命名为PA_SD_1株 )的染色体DNA为模板 ,成功扩增出了该菌的主要致病基因 (绿脓杆菌外毒素A)Ⅲ区基因。将该PCR扩增片段与pGEMR_TEasy载体连接 ,获得了含有目的片段的重组质粒 (命名为PA_SD_ETA)。序列测定结果表明。该菌株与其他已报道的绿脓杆菌菌株有较高的同源性 ,而局部出现单个碱基的点突变。

hTNF-α单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆和序列及分子结构分析

从两株具有高亲和力及中和活性的抗人肿瘤坏死因子－α（ｈＴＮＦ－α）的单抗杂交瘤细胞株１Ｃ３、３Ｆ６中分别提取总ＲＮＡ，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆了抗体的ＶＬ、ＶＨ基因。核苷酸序列分析表明，所克隆基因均为抗体的ＶＬ、ＶＨ基因，并分别属于Ｋａｐｐａ链Ⅳ亚组和重链Ⅲ（Ｄ）亚组。此外，两抗体可变区分子模型及与ｈＴＮＦ－α的结合模型的建立及分析，为进一步的基因工程抗体研究及抗原－抗体相互作用机理的研究奠定了基础。

抗重组人bFGF单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达

目的:从分泌抗重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞株B2F3中克隆抗体可变区(V)基因,构建bFGF单链抗体(scFv),并进行可溶性表达。方法:从分泌bFGF mAb杂交瘤细胞株B2F3提取总RNA,用RT-PCR方法扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链的可变区基因(VL);再通过重叠延伸拼接(SOE)PCR方法,在VH和VL基因之间引入linker(Gly4Ser)3,构建bFGFscFv。将测序正确的scFv基因克隆到表达载体pCANTAB5E中,选择非抑制型菌株E.coli HB2151进行可溶性表达;经SDS-PAGE检测抗体表达水平,ELISA鉴定其抗原结合活性。结果:测序分析结果显示,VH基因序列全长375碱基对,编码125个氨基酸,VL基因序列全长399碱基对,编码133个氨基酸,二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有4个框架区(FR)、3个抗原互补决定区(CDR)及抗体特征性的2个半胱氨酸残基;构建的scFv全长789碱基对,编码263个氨基酸,连接结构为VH-linker-VL。SDS-PAGE分析表明scFv基因在大肠杆菌为可溶性表达,表达产物主要位于周质腔中,表达产物的Mr为27000,与理论预期值相符;间接ELISA检测结果显示原核表达的scFv具有与bFGF特异性结合的活性。结论:成功地克隆bFGF mAb可变区基因,并构建表达bFGF scFv,为下一步研究bFGF抗体人源化改造奠定实验基础。

HCVC区基因在SP2/0细胞及荷瘤小鼠瘤内的表达

目的 观察HCVC区基因在SP2 / 0细胞及荷瘤小鼠瘤内的表达情况 .方法 构建pEF HCVC重组质粒 ,转染SP2 / 0细胞 ,经G4 18进行筛选 ,建立稳定转染pEF HCVC的SP2 / 0细胞系 .并将转染后的SP2 / 0细胞接种于BALB/c小鼠皮下产生浆细胞瘤 .结果 用斑点杂交方法检测转染后的细胞 ,有HCVmRNA .免疫组化检测瞬时转染以及稳定转染的SP2 / 0细胞涂片均发现存在有阳性信号 .另外 ,对瘤组织进行免疫组化检测 ,发现有HCVC蛋白表达 .结论 pEF HCVC重组质粒可以在SP2 / 0细胞中长期稳定表达 ,也可以在BALB/c小鼠浆细胞瘤内表达 .

旋毛虫各隔离种ITSⅡ区基因克隆和序列分析

克隆了6个不同旋毛虫隔离种的核糖体RNAITSⅡ区的基因片段,序列分析结果表明,黑龙江省猪旋毛虫和猫旋毛虫为旋毛形线虫(Trichinellaspiralis);犬旋毛虫为本地毛形线虫(Trichinellanativa)。结果与传统的分类结果基本一致,为传统的分类学方法提供了基础依据。

应用基因芯片技术检测乙型肝炎病毒前-C区/BCP区基因突变的研究

目的 探讨利用基因芯片技术检测乙型肝炎病毒 (HBV)前 C区 /BCP区基因突变方法的临床价值及前 C区 /BCP区基因突变的临床意义。方法 应用基因芯片技术检测 4 6例急慢性肝病的HBV前 C区A1896 (nt1896G→A)、A1899(nt1899G→A)及HBVC基因启动子 (BCP)T176 2A176 4 (nt176 2A→T、nt176 4G→A)四位点突变 ,并探讨该技术的临床应用价值。结果 用基因芯片法测定HBV基因特定变异位点特异性强 ,阳性率为 87 0 %。A1896突变 18例 (4 5 0 % ) ,A1899突变 10例 (2 5 0 % ) ,T176 2A176 4联合突变 30例(75 0 % ) ,多位点突变 14例(35 0 % )。各变异组与未变异组比较 ,肝功损害均有显著性差异 (P <0 0 5～ 0 0 1)。前 C区 /BCP区基因突变在乙型肝炎肝硬化及慢性乙型肝炎中较为常见 ,在急性乙型肝炎中未检出。结论 应用基因芯片法测定HBV特定变异位点特异性强 ,可一次同时检测多个突变位点 ,具有一定的临床应用价值。

甲型肝炎病毒龙甲株结构区基因cDNA序列分析及其克隆

我国的甲型肝炎病毒龙甲株，经免疫捕获病毒颗粒，再进行反转录和聚合酶链反应（ＰＣＲ），获得结构基因区ｃＤＮＡ，用双脱氧法直接测定序列。结果表明，甲肝病毒在结构蛋白基因区有高度的保守性。将我国龙甲株病毒的结构区基因与甲肝病毒ＨＭ１７５野毒株和ＭＢＢ作比较，发现其核苷酸变异率分别为４．５％和３．１％，氨基酸变异均为０．１３％。从结构区基因各区段来看，核苷酸变异主要发生在ＶＰ１和ＰＶ３区域。