噬菌体随机十二肽库淘选三水白虎汤作用于类风湿关节炎滑膜细胞的靶点研究

目的:利用噬菌体随机十二肽库淘选出与三水白虎汤(SSBH)作用的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RASFs)特异性结合的多肽,寻找SSBH治疗类风湿关节炎的蛋白靶点。方法:以SSBH处理过的RASFs为靶细胞,生理盐水(NS)处理的RASFs为吸附细胞,全细胞差减筛选法对噬菌体十二肽库进行3轮淘选,挑取单克隆、扩增纯化噬菌体,并初步鉴定噬菌体克隆的亲和力,阳性克隆测序后进行生物学分析。结果:3轮淘选后,随机挑选32个噬菌体克隆进行DNA序列分析,展示SGVYKVAYDWQH十二肽的噬菌体被富集约为56%(18/32)。结论:从噬菌体肽库筛选到SSBH作用RASFs的特异性结合短肽,并分析出相关作用蛋白。

用噬菌体十二肽库筛选日本血吸虫病诊断抗原

目的 从噬菌体十二肽库中筛选出特异、灵敏的日本血吸虫病诊断抗原。 方法 以日本血吸虫急感患者血清免疫球蛋白 (Ig)作为靶分子 ,免疫筛选噬菌体随机十二肽库。经过 3轮吸附 洗脱 扩增的淘筛过程 ,随机挑取 10个蓝色噬菌斑扩增 ,用ELISA检测其免疫活性 ,并通过对并殖吸虫病及旋毛虫病患者血清的检测分析其诊断日本血吸虫病的价值。 结果 6个克隆可以与日本血吸虫急感患者血清免疫球蛋白 (Ig)特异结合。其中A492 值最高的克隆(SjA1)具有较好的特异性和灵敏性。 结论 从噬菌体随机十二肽库中筛选到的克隆对日本血吸虫病具有较高的诊断价值。

环十二肽溶液构象的二维核磁共振研究

利用二维核磁共振方法及距离几何计算研究了在片段组装法全新蛋白质合成中用作底座分子的环十二肽的溶液构象.研究结果表明在环十二肽分子主链中包含四个转角结构,四个赖氨酸侧链均位于环的同一侧.环肽的构象为以环肽为模板组装四螺旋束分子提供了有利的条件.

从噬菌体十二肽库中筛选MMP-2抑制剂的研究

为了筛选抑制MMP 2 (基质金属蛋白酶 2 )的小分子多肽 ,以纯化MMP 2为目标蛋白 ,经 3轮筛选 ,并通过ELISA分析 ,从噬菌体展示 12肽库中获得 6个阳性克隆 ;经DNA测序并推导小肽序列 ,分析序列保守性 ,找到一个保守序列模式“HWKF” ,经明胶酶谱活性检测具有该序列的噬菌体克隆能明显抑制MMP 2水解明胶活性 ,该研究为肿瘤的生物治疗和临床应用提供了一定的帮助。

利用十二肽库筛选心肌型脂肪酸结合蛋白特异性的亲和配体

采用噬菌体表面展示十二肽库对心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)特异性亲和配体进行筛选,经3轮筛选及序列比对后得到一个酶联免疫测定分析(ELISA)检测阳性特征序列:W-P-N-H-H-M-L-H-K-R-W-P.对此序列进行肽合成,并标记上荧光标记物芘,经高效液相纯化、冻干及质谱确定其分子量后制成荧光肽探针检测急性心肌梗塞病人血样,结果均呈阳性.结果表明,所获得的肽探针具有较好的临床应用效果.

应用噬菌体随机十二肽库筛选hFGF-7相关模拟肽

目的应用噬菌体随机十二肽库生物淘选具有刺激表皮细胞增殖作用的人成纤维细胞生长因子-7(hFGF-7)噬菌体模拟肽。方法以hFGF-7单克隆抗体为靶,进行4轮生物淘选噬菌体随机十二肽库;随机挑取单克隆噬菌体,应用ELISA方法检测单克隆噬菌体的结合力,对结合力较好的单克隆噬菌体提取噬菌体DNA,进行测序,并行序列分析。结果经过4轮生物淘选,特异性噬菌体模拟肽获得了富集,ELISA检测结果显示获得的一些噬菌体模拟肽具有较好的结合力,测序获得11个与促进细胞分裂、增殖或抑制细胞增殖有关的碱基序列。结论从噬菌体随机十二肽库中可淘选到与hFGF-7相关的噬菌体模拟肽,其中部分噬菌体模拟肽可能会促进表皮细胞增殖,期望将来可应用于促进创面愈合。

铜-(N-正十二碳酰双甘肽)配合物模拟SOD研究

合成一种新的 SOD模拟物带功能基的长链铜 ( )氨基酸配合物 N -正十二碳酰双甘肽合铜[Cu( C1 2 -Gly-Gly) ]和二 -( N-正十二碳酰双甘肽合铜 ) [Cu( C1 2 -Gly-Gly) 2 ].用脉冲辐解法测定了其 SOD样活性 ,发现 Cu( C1 2 -Gly-Gly) 2 的 SOD样活性基本接近于天然 SOD,达到了整体模拟 SOD的效果 .

噬菌体展示肽库筛选VPAC1高亲和力结合多肽

目的通过噬菌体展示肽库技术筛选VPAC1高亲和力结合十二肽配体,并进行特异性和亲和力鉴定。方法建立稳定表达VPAC1的真核细胞系;利用噬菌体肽库展示技术进行全细胞差减筛选,随机挑取40个噬菌体克隆进行测序,初步鉴定确定阳性克隆,明确外源十二肽序列,固相合成该十二肽;利用体外竞争结合ELISA及流式细胞分析,鉴定目标多肽与VPAC1受体结合的特异性及亲和力。结果成功构建稳定表达VPAC1细胞系;经过4轮差减筛选,回收噬菌体逐轮得到富集,随机挑取40个克隆测序,共得到15条序列不同的多肽,经ELISA鉴定有7个克隆与细胞有特异性高结合能力;阳性噬菌体克隆与细胞结合通过多肽VP1介导;VP1能特异高亲和地与VPAC1受体结合。结论通过噬菌体展示肽库技术成功筛选得到与VPAC1高亲和力特异结合十二肽。

噬菌体肽库筛选转化生长因子βⅡ型受体亲和肽

目的:从噬菌体随机肽库中筛选转化生长因子β(TGF-β)Ⅱ型受体的亲和短肽。方法:以重组可溶性人TGF-βⅡ型受体作为靶标,应用噬菌体随机十二肽库进行筛选,经过3轮淘选,提取阳性噬菌体克隆ssDNA,测序并进行序列分析。结果:通过筛选噬菌体获得富集,挑选10个能与人TGF-βⅡ型受体特异性结合的噬菌体克隆,测序得到4个核酸序列,未发现共有保守序列。结论:通过噬菌体肽库技术能筛选出与TGF-βⅡ型受体结合的噬菌体展示肽,为进一步研究TGF-βⅡ型受体亲和短肽及在抗肝纤维化中的作用提供依据。

双靶向MMP-14和金属离子的结合肽筛选与分子模拟

以基质金属蛋白酶-14(MMP-14)催化结构域为靶标,通过噬菌体随机十二肽库筛选和分子模拟、细胞免疫荧光、金属离子亲和层析以及体外细胞作用测定等技术,进行了双靶向MMP-14和金属离子小分子结合多肽的筛选与研究.经4轮筛选,噬菌体得到有效富集并获得13条不同的多肽序列.序列分析显示,可能的一致序列有:AHQLH、HHXH、EI/LPLL/I.分子模拟与对接进一步确认一致序列AHQLH、HHTH、LPLL与MMP-14催化结构域的氨基酸120-125区域良好分子对接并具有一定的专一性,多条MMP-14结合肽不仅靶向MMP-14,同时结合金属离子.细胞生物学研究确认,所测定的结合肽噬菌体对MMP-14诱导表达的MG63细胞具有良好的结合作用,揭示结合肽对MMP-14的靶向结合特性,并且合成的AHQLH、LPLL一致序列多肽对MG63细胞活力具有一定的抑制能力.这些新的和具有一定MMP-14专一性的一致序列可望用于靶向MMP-14抗肿瘤药物的研发和利用.

有机磷农药广谱抗原表位多肽的制备及应用

利用噬菌体展示技术,以广谱型单克隆抗体筛选十二肽噬菌体展示库,获得能够模拟有机磷类农药抗原表位的十二肽,建立了一种间接竞争ELISA方法用于检测多种有机磷类农药。结果表明,获得的特异性多肽氨基酸序列为HPAPDHSSQSHQ,呈现出较好的抗原性、亲水性及表面可及性,可广谱模拟有机磷农药抗原表位。所建立的间接ELISA方法对有机磷农药通用结构半抗原(BPB)的IC50和IC10分别为1.776μg/ml及0.358μg/ml,与对硫磷、蝇毒磷、乙拌磷、辛硫磷、喹硫磷和三唑磷的交叉反应率分别为58.74%、44.93%、52.03%、43.98%、36.82%和4.87%。建立的检测方法具有绿色、广谱、高效的特点,是一种新型有机磷类农药累积毒性检测技术。

乳腺癌原代细胞特异性多肽的筛选

目的利用噬菌体展示技术从噬菌体随机十二肽库中筛选出能够特异性结合乳腺癌原代细胞的噬菌体多肽。方法以乳腺正常细胞为减性筛选细胞、乳腺癌原代细胞为靶细胞,对从商业购买的噬菌体随机十二肽库进行筛选,选取富集后的单克隆噬菌体,ELISA鉴定阳性噬菌体的特异性及亲和力,扩增阳性噬菌体克隆并提取DNA,测序后进行比对。结果经过3轮筛选,噬菌体得到近100倍富集,随机挑选11株单克隆噬菌体,ELISA鉴定显示2号噬菌体对乳腺癌细胞具有较高特异性及亲和力,测序结果显示其表达的多肽序列为未知序列。结论利用噬菌体筛选技术成功筛选出能够特异性结合乳腺癌原代细胞的特异性多肽,为进一步合成多肽应用于靶向治疗乳腺癌奠定基础。

乳腺癌干细胞富集及其特异性多肽的筛选

目的:无血清培养法富集乳腺癌干细胞(breast cancer stem cell,BCSC)并采用噬菌体展示技术,筛选能特异性结合乳腺癌干细胞的噬菌体多肽。方法:无血清培养法富集乳腺癌MDA-MB-231细胞株中干细胞并以此为靶标,以hs578bst人正常乳腺细胞及普通培养的MDA-MB-231细胞为减性筛选细胞,对噬菌体随机肽库进行双重减性筛选,选取富集后的阳性噬菌体单克隆,ELISA及DAB染色鉴定阳性噬菌体特异性并测序。结果:经过3轮筛选,噬菌体得到约500倍的富集,随机挑选10株单克隆噬菌体。ELISA显示,6号噬菌体单克隆对乳腺癌干细胞的亲和力是对照的6.14倍;DAB鉴定亦显示,其对乳腺癌干细胞的特异性及亲和力最高,对阳性噬菌体DNA测序翻译得到十二肽氨基酸为GYSASRSTIPGK。结论:通过干细胞富集及噬菌体展示技术,成功筛选出能够特异性结合乳腺癌干细胞的特异性噬菌体多肽,为乳腺癌的干细胞靶向治疗和深入研究奠定基础。

禽传染性支气管炎病毒N蛋白保守B细胞抗原表位的鉴定

应用噬菌体随机十二肽库技术对针对IBV GX-YL5株N蛋白的单抗N2D5进行抗原表位的鉴定。将淘选得到的噬菌体随机十二肽库第3轮洗脱液进行二代测序,将测序结果中出现频率最高的3个十二肽序列合成肽后验证是否为模拟表位;根据获得的模拟表位预测相应的天然表位序列并合成多肽和原核表达进行验证,同时对获得的天然表位进行保守性和交叉反应性分析。结果显示,第3轮筛选洗脱液测序出现频率最高的3个序列中有2个为模拟表位,即VVGRAMAYSTIP和DGVLLGTSGEST;预测天然表位序列为158IPLNRGRGGRST169;预测天然表位的合成肽的ELISA和Dot-blotting分析以及其原核表达蛋白的Western-blotting分析表明,158IPLNRGRGGRST169是IBV的一个天然表位序列;保守性和交叉反应性分析显示该天然表位具有高度保守性。结果表明,本研究成功鉴定出IBV GX-YL5 N蛋白上的一个高度保守的表位158IPLNRGRGGRST169,为IBV N蛋白的抗原结构和功能的研究及诊断试剂和表位疫苗的研制奠定了基础。

我国HIV-1流行株gp41抗原表位筛选与串联表达

目的 探讨HIV 1gp4 1抗原表位串联表达蛋白用于HIV抗体检测的可行性。方法用HIV 1gp4 1蛋白亲和层析柱制备HIV 1感染者血清中的多克隆抗体 ,用噬菌体展示随机十二肽库进行生物淘洗 ,反向吸附非特异性噬菌体。经ELISA鉴定阳性克隆 ,DNA测序 ,确定优势表位。将优势表位与文献报道的另一个优势表位串联 ,克隆入pQE30载体进行蛋白表达。结果 成功筛选到位于HIV 1gp4 1蛋白上的优势抗原表位 (YGPKDAETTAIW ) ,串联表位 (YGPKDAETTAIW GGGS SC SAKFTCTTQI)在pQE30载体中实现可溶性表达。重组蛋白具有良好的抗原性 ,能与不同的HIV 1抗体阳性血清呈特异反应。结论 HIV 1gp4 1抗原表位串联表达设计是可行的 ,串联表位重组蛋白可用于HIV 1抗体检测 ,但检测灵敏性低于常规方法。

铜绿假单胞菌抗原基因细胞定位分析

目的筛选刺激机体产生抗体的铜绿假单胞菌优势抗原表位,分析铜绿假单胞菌抗原基因的定位。方法收集健康人和铜绿假单胞菌感染患者血清,应用噬菌体展示十二肽库进行1轮阴性选择淘选和3轮生物淘选,对阳性克隆单噬菌体进行测序,与PAO1基因组序列比对分析。结果 30个阳性克隆单噬菌体,测序得到12种序列。与PAO1基因组序列比对得到673个基因,细胞定位为胞浆、内膜、周质、外膜、胞外和未知,所占比例分别为49%、22%、6%、6%、2%和15%。基因产物按功能分为26类,各部位的基因与细胞功能一致。结论推测胞外和外膜中"细胞壁/脂多糖/荚膜"类、"分泌因子"类和"运动及黏附"类抗原可用于疫苗研究。