HPLC法同时测定清开灵注射液中黄芩苷和千层纸素A-7-O-β-d-葡糖醛酸苷的含量

目的：建立同时测定清开灵注射液中黄芩苷和千层纸素A-7-O-β-d-葡糖醛酸苷含量的方法，并比较不同厂家、批号产品中黄芩苷和千层纸素A-7-O-β-d-葡糖醛酸苷的含量差异。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18，流动相为甲醇-0．1％磷酸溶液（梯度洗脱），流速为1．0ml／min，检测波长为274nm，柱温为30℃，进样量为10ul。结果：黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-d-葡糖醛酸苷检测质量浓度分别在10．1-252．0、1．0～6．0ug／ml范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系（r=0．9999）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD≤1．6％；平均加样回收率分别为99．64％、99．03％，RSD分别为2．7％、0．9％（n=6）。不同厂家、批号产品中黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-d-葡糖醛酸苷的质量浓度范围分别为4．151～4．849、0．097-0．157mg／ml。结论：该方法简单、准确、可靠，适用于清开灵注射液的质量控制；不同厂家、批号清开灵注射液中黄芩苷和千层纸素A-7-O-β-d-葡糖醛酸苷的含量存在较大差异。

一测多评法同时测定十一味定喘口服液中5种成分的含量

目的建立一测多评法同时测定十一味定喘口服液中黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵的含量。方法分析采用Welch Ultimate XB C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相乙腈-0.1%磷酸,梯度洗脱;体积流量1 mL/min;柱温30℃;检测波长254 nm。以黄芩苷为内标,计算其他4种成分的相对校正因子,测定其含量。结果5种成分在各自范围内线性关系良好(r>0.9993),平均加样回收率97.27%~104.89%,RSD 0.16%~1.70%。一测多评法所得结果与外标法接近。结论该方法专属性强,准确度高,稳定可靠,可用于十一味定喘口服液的质量控制。

大鼠胆汁中黄芩苷代谢物的分离、纯化及其对肝癌细胞HepG2增殖的影响研究

目的:从大鼠胆汁中分离纯化黄芩苷的代谢物,并研究其对肝癌细胞HepG2增殖的影响。方法:取6只SD大鼠,麻醉后进行胆管插管,待大鼠清醒后,灌胃给予黄芩苷(168 mg/kg),收集灌胃给药后24 h的胆汁样品1,经处理后,采用高效液相色谱法进行初步分析;另取5只SD大鼠,同上述方法麻醉、插管后,灌胃给予黄芩苷(400 mg/kg),并收集灌胃给药后48 h的胆汁样品2,经处理后,采用半制备型高效液相色谱法对代谢物进行分离纯化;采用紫外光谱、红外光谱、质谱、核磁共振技术并结合其理化性质对分离得到的代谢物进行鉴定;采用MTT法及高内涵细胞成像分析法研究代谢物对HepG2细胞增殖的影响。结果:黄芩苷通过胆汁主要代谢成代谢物1和代谢物2,经分离纯化后分别鉴定为千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和黄芩素6-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。MTT法结果显示,代谢物2对HepG2细胞具有显著的增殖抑制作用,其半数抑制浓度(IC50)为90μg/mL;高内涵细胞成像分析法结果显示,在一定浓度下,代谢物2可能通过改变HepG2细胞线粒体分布及膜通透性从而抑制细胞增殖(代谢物1的药理活性已有报道,本研究略去)。结论:成功分离并鉴定出2个黄芩苷的胆汁代谢物,其中代谢物2黄芩素6-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对HepG2细胞具有显著的增殖抑制作用。

痰热清注射液特征图谱建立及4种成分测定

目的 建立痰热清注射液(黄芩、金银花、连翘等)特征图谱,并测定野黄芩苷、黄芩苷、千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷含量。方法 该药物的分析采用Diamonsil Plus C_(18)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相乙腈-0.1%甲酸,梯度洗脱;体积流量0.8 mL/min;柱温25℃;检测波长280 nm。以黄芩苷为内标,建立其他3种成分的相对校正因子,一测多评法计算其含量。结果 33批样品特征图谱中有12个共有峰,相似度均大于0.97。4种成分在各自范围内线性关系良好(r=1.000 0),平均加样回收率96.2%~102.4%,RSD 0.7%~1.8%。一测多评法所得结果(千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷含量)与外标法接近。结论 该方法稳定可靠,可用于痰热清注射液的质量控制。

UPLC-MS/MS同时测定双黄连口服液中17种有效成分

目的建立超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）同时测定双黄连口服液中17种成分（新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、异连翘酯苷、连翘酯苷A、连翘苷、芦丁、黄芩素、黄芩苷、野黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖苷、汉黄芩素、千层纸素A）的分析方法。方法采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm,1.7μm）,以乙腈-甲醇（4∶1）-0.4%甲酸水为流动相,梯度洗脱,体积流量为0.4 m L/min,柱温40℃,采用电喷雾电离源（ESI）,多反应离子监测（MRM）扫描方式进行检测,分析时间为7 min。结果所测17种有效成分在测定质量浓度范围内线性关系良好,r^2均大于0.990 1,实验精密度、准确度和稳定性良好,平均加样回收率为95.81%～102.42%,所测5批样品中17种成分定量范围依次为新绿原酸782.68～1 034.27μg/m L、绿原酸786.35～1 103.77μg/m L、隐绿原酸898.00～1 238.94μg/m L、咖啡酸82.85～115.17μg/m L、3,5-二咖啡酰奎宁酸226.02～461.63μg/m L、3,4-二咖啡酰奎宁酸191.59～404.21μg/m L、异连翘酯苷243.62～298.51μg/m L、连翘酯苷A 978.43～1 487.37μg/m L、连翘苷351.97～435.82μg/m L、芦丁41.19～75.65μg/m L、黄芩素40.28～73.73μg/m L、黄芩苷10 080.54～10 820.35μg/m L、野黄芩苷40.88～50.51μg/m L、汉黄芩苷187.73～204.85μg/m L、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖苷144.92～335.08μg/m L、汉黄芩素9.30～25.58μg/m L、千层纸素A 7.51～16.58μg/m L。结论方法简单、快速、准确度及灵敏度高、专属性好,可用于双黄连口服液中3大类17个主要成分的快速定量测定。

基于“辨状论质”理论分析不同采收期黄芩外观性状与内在质量的相关性

目的探索不同采收期黄芩Scutellaria baicalensis外观性状与内在成分含量之间的关联性,为黄芩的“辨状论质”提供理论依据。方法通过分光测色仪及游标卡尺测定黄芩外观性状指标(药材粉末颜色、根长、根粗),采用HPLC测定黄芩12种黄酮类成分(野黄芩苷、野黄芩素、黄芩苷、木犀草素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、芹菜素、去甲汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A)含量。运用皮尔逊相关性分析和线性回归分析黄芩外观性状与有效成分含量之间的关系。并对黄芩“外观性状指标-成分含量-产量”进行主成分分析。结果黄芩外观性状与有效成分含量有相关性,但无显著性回归关系。黄芩色黄明者,黄酮苷类成分含量相对较高;色暗、根长、根粗者,黄酮苷元类成分含量相对较高。陕西省淳化地区黄芩药材秋季较适宜采收期为“寒露”节气前后。结论黄芩饮片的色泽是其内在质量的具体体现,黄芩外观性状在一定程度上可作为快速评价黄芩药材质量的方法,为黄芩“辨状论质”提供理论依据,以指导黄芩的采收与药材优劣辨别。

基于网络药理学的痰热清胶囊治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)机制研究

目的探索痰热清胶囊治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的网络调控机制。方法选取痰热清胶囊中19个主要成分为研究对象,利用Swiss Target Prediction服务器和TCMSP数据库预测化合物潜在作用靶点,借助Omicsbean分析系统与String 10数据库对靶点进行基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析和信号通路分析,利用Cytoscape 3.6.1软件进行可视化处理。结果 19个化合物可通过作用于163个相关靶点干预68条关键信号通路,如白细胞介素-17(IL-17)信号通路、T细胞受体信号通路、花生四烯酸代谢、cAMP信号通路、PI3K-Akt信号通路、甲型流感等,主要涉及抗炎、免疫调节、解热、化痰、镇咳平喘、止痛、抗菌、抗病毒、镇静等方面,构建了痰热清胶囊"化合物-靶点-通路-药理作用-功效"网络。结论痰热清胶囊中主要化学成分野黄芩苷、黄芩苷、千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷、连翘苷、连翘酯苷E、连翘酯苷D、绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸等可能通过作用于TNF、EGFR、NOS3、PTGS2、IL2、GABBR1、MAPK14、ADRB2、REN、VCAM1、ACHE、PTPRC等关键蛋白干预了多个与清热、化痰、解毒相关的生物过程,从而发挥对COVID-19的治疗作用。

金振口服液HPLC-UVD-ELSD特征指纹图谱及13个成分同时定量的整体质量控制研究

目的建立金振口服液(Jinzhen Oral Liquid,JOL)高效液相色谱-紫外真空波-蒸发光散射检测器(HPLC-UVD-ELSD)特征指纹图谱,结合13个主要代表性成分(没食子酸、甘草苷、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、甘草素、黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、千层纸苷、汉黄芩苷、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-β-D葡萄糖苷、甘草酸、猪去氧胆酸、胆酸)同时定量的方法,对市售制剂进行整体质量控制。方法采用Cosmosil-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);检测波长为254nm;ELSD漂移管温度115℃;载气体积流量2.0L/min;以甲醇-水(含0.1%甲酸)为流动相进行梯度洗脱,建立JOL的HPLC-UVD-ELSD特征指纹图谱,对主要特征峰进行明确化学指认并确定组方中药来源,运用相似度软件对15批市售制剂进行相似度评价,同时在市售制剂批间差异小的前提下测定主要代表性成分的含量。结果建立了JOL的HPLCUVD-ELSD指纹图谱结合13个代表性成分同时定量的方法;覆盖该复方4味组方中药的15个主要特征峰得到明确化学指认,分别为没食子酸(1号峰)、甘草苷(5号峰)、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(7号峰)、甘草素(11号峰)、黄芩苷(13号峰)、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸(16号峰)、千层纸苷(17号峰)、汉黄芩苷(18号峰)、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷(19号峰)、大黄酚1-O-β-D-葡萄糖苷(20号峰)、大黄酸(24号峰)、甘草酸(26号峰)、(18β,20α)-甘草酸(27号峰)、猪去氧胆酸(28号峰)、胆酸(29号峰),并初步确定了29个特征峰的组方中药来源分别为8、12、13、15~18号峰归属于黄芩,3~5、10、11、25~27号峰归属于甘草,1、6、7、9、14、19、20、24号峰归属于大黄,2号峰归属于平贝母,28、29号峰归属于人工牛黄,21~23号峰归属于辅料;15批市售制剂的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度值在0.968~1.000;13个定量成分线性关系良好(R2=0.9990~0.9999),且平均回收率为96.90%~102.84%,15批市售制剂定量成分的质量浓度分别为没食子酸51.82~148.27μg/mL、甘草苷75.04~130.00μg/mL、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷31.72~39.84μg/mL、甘草素14.24~43.65μg/mL、黄芩苷610.37~867.40μg/mL、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸12.87~34.09μg/mL、千层纸苷62.45~101.48μg/mL、汉黄芩苷155.41~205.86μg/mL、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷11.56~23.72μg/mL、大黄酚-8-O-β-D葡萄糖苷16.14~36.87μg/mL、甘草酸222.97~310.32μg/mL、猪去氧胆酸177.48~239.70μg/mL、胆酸98.54~132.85μg/mL。结论所建立的金振口服液HPLC-UVD-ELSD特征图谱和定量测定分析方法为进一步提升制剂整体质量标准提供了重要证据。

黄芩水煎液中化学成分的定性及定量研究

目的 分析黄芩Scutellaria baicalensis水煎液中的化学成分,并对其中的主要成分进行定量研究,为黄芩质量标准的建立和进一步研究提供参考依据。方法 定性分析采用UHPLC LTQ-Orbitrap MS技术,0.1%甲酸水-乙腈为流动相,梯度洗脱,分析化合物的精确相对分子质量及碎片离子信息。通过对照品对比、分析化合物质谱裂解碎片推测未知物。定量分析采用HPLC-UV技术,1%乙酸水溶液-乙腈为流动相,梯度洗脱,测定10批黄芩中主要成分含量。结果 从黄芩水煎液中分析鉴定了86种化合物,含65个黄酮、11个有机酸、7个氨基酸、2个苯乙醇苷、1个其他类化合物。对黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、黄芩素、汉黄芩素及千层纸素A进行了含量测定,结果表明黄芩不同批次之间的黄酮类成分含量有一定差异,但6个黄酮的总量相对稳定(18.09%~25.33%,RSD为9.95%)。结论 全面分析了黄芩水煎液的化学成分,并建立了6个黄酮成分的定量分析方法,可为黄芩的质量控制和质量标准建立提供数据参考。

基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS谱-效相关的柴胡-黄芩药对解热质量标志物的筛选及含量测定方法的建立

目的筛选柴胡-黄芩(柴黄)药对解热作用质量标志物(qualitymarker,Q-Marker),并建立Q-Marker的UPLC含量测定方法。方法采用均匀设计法建立柴黄药对配伍差异样品,利用超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱质谱(UPLCQ-Exactive Orbitrap-MS)技术建立柴黄药对煎液指纹图谱,采用Thermo Scientific Hypersil Gold C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,3μm),以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,体积流量0.3 mL/min,并采用电喷雾电离,正离子扫描模式下进行质谱数据采集。采用新西兰兔耳缘静脉脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)注射的方法建立少阳证高热模型,以体温变化值作为解热药效指标,采用灰色关联度分析法建立指纹图谱中共有峰与解热作用的相关关系,筛选出关联性较大的成分作为柴黄药对解热作用的主要Q-Marker,采用UPLC建立Q-Marker含量测定方法。结果筛选出黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、去甲汉黄芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷A、柴胡皂苷C作为柴黄药对解热Q-Marker,并建立了含量测定方法。结论基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技术的谱-效相关研究策略可以快速分析及初步确定柴黄药对解热Q-Marker,在此基础上建立其UPLC含量测定方法,对优化柴黄类方制剂的质量控制方法具有重要的参考价值。

基于指纹图谱和网络药理学对经典名方二冬汤质量标志物(Q-Marker)预测分析

目的 基于指纹图谱和网络药理学方法,分析预测二冬汤潜在的质量标志物(quality markers,Q-Marker)。方法 采用HPLC建立15批二冬汤指纹图谱,并对其峰进行指认和归属,同时采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012版),并结合层次聚类分析(hierarchical clustering analysis,HCA)对结果进行分析、评价不同批次样品质量差异;基于可测性和可溯源性筛选出6个Q-Marker候选成分,通过网络药理学构建二冬汤“成分-靶点-通路”的网络,分析二冬汤的潜在Q-Marker。结果 建立了26个共有峰的指纹图谱,指认了新芒果苷、芒果苷、金丝桃苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸铵、千层纸素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷7个共有色谱峰,15批指纹图谱与对照图谱相似度均大于0.97,15批样品聚为2类;采用网络药理学的方法分析得出新芒果苷、芒果苷、金丝桃苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸铵6个成分可能为二冬汤潜在的Q-Marker,其可能通过调节胰岛素、Ras相关蛋白1(Ras-associated protein 1,Rap1)、肝炎等信号通路发挥养阴清热、生津止渴的功效。结论 建立的指纹图谱分析方法灵敏度高、稳定性强、数据准确可靠;并结合网络药理学研究发现6个成分具有传递性和溯源性,且与二冬汤功效有关,可作为其潜在的Q-Marker,为二冬汤进一步研究提供参考。

基于“成分-靶点-代谢”预测分析黄芩酒炙前后质量标志物

目的基于"成分-靶点-代谢"关系筛选黄芩酒炙前后质量标志物(Q-marker)。方法依据黄芩酒炙前后差异性化学成分,结合网络药理学与代谢组学,构建"差异成分-作用靶点-代谢组学"网络关系;将黄芩中黄酮苷类成分与苷元成分、差异成分与内源性代谢物进行相关性分析。挖掘生黄芩和酒黄芩Q-marker。结果整合网络药理学与代谢组学结果,预测分析得到黄芩苷、千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷为生黄芩潜在Q-marker;黄芩素、汉黄芩素为酒黄芩潜在Q-marker。结论酒炙促进黄芩中苷元类活性成分的溶解和吸收是其炮制的重要机制。中药饮片炮制前后的差异鉴定、网络药理学及代谢组学的结合为发现和确认中药质量标志物提供思路和方法。

基于一测多评法对小儿豉翘清热颗粒中9个成分的质量控制

目的:建立一测多评(QAMS)法测定小儿豉翘清热颗粒中栀子苷、芍药苷、连翘酯苷A、黄芩苷、连翘苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素9个成分的含量。方法:采用超高效液相色谱法,Acquity UPLC BEH C_(18)色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7μm);乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液为流动相(B),梯度洗脱;流速0.25 mL·min^(-1),柱温25℃,检测波长220 nm。以黄芩苷为内参物,建立栀子苷、芍药苷、连翘酯苷A、连翘苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素与内参物黄芩苷的相对校正因子(f),通过f计算小儿豉翘清热颗粒中9个成分的含量,并进行验证,将该方法与外标法(ESM)的测定结果进行对比分析,以验证QAMS方法的准确性、重复性及可行性。结果:栀子苷、芍药苷、连翘酯苷A、黄芩苷、连翘苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的质量浓度分别在9.953～199.1μg·mL^(-1)、5.994～119.9μg·mL^(-1)、4.390～87.80μg·mL^(-1)、9.819～196.4μg·mL^(-1)、1.802～36.04μg·mL^(-1)、1.408～28.17μg·mL^(-1)、2.551～51.02μg·mL^(-1)、0.140 2～2.804μg·mL^(-1)、0.361 3～7.225μg·m L^(-1)范围内线性关系良好;加样回收率在95.7%～102.5%;以黄芩苷为内参物,测得的f值分别为4.621 1、4.105 5、1.825 3、1.796 5、1.040 2、1.339 8、0.647 4、0.888 7,且建立的QAMS法计算结果与外标法(ESM)的计算结果之间无显著性差异。结论:本实验建立的QAMS法可作为一种简便快捷的质量评价模式,用于小儿豉翘清热颗粒中9个成分的质量控制。

LC-MS/MS法同时测定小儿豉翘清热颗粒中13个成分的含量

目的:建立LC-MS/MS法同时测定小儿豉翘清热颗粒中栀子苷、芍药内酯苷、芍药苷、连翘酯苷A、甘草苷、黄芩苷、连翘苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、大黄酸、甘草酸共13个成分的含量。方法:采用Poroshell 120 SB-C;色谱柱(100 mm×3.0 mm,2.7μm),以0.1%甲酸水与甲醇-乙腈(1∶1)为流动相,梯度洗脱,流速0.45 mL·min^(-1),柱温40℃;采用电喷雾(ESI)离子源,多反应监测模式(MRM)进行负离子扫描。结果:栀子苷质量浓度在9~900 ng·mL^(-1),芍药内酯苷在1~100 ng·mL^(-1),芍药苷在12~1200 ng·mL^(-1),连翘酯苷A在12~1800 ng·mL^(-1),甘草苷在1~100 ng·mL^(-1),黄芩苷在8~800 ng·mL^(-1),连翘苷在5~500 ng·mL^(-1),千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷在5~500 ng·mL^(-1),汉黄芩苷在5~500 ng·mL^(-1),黄芩素在2~200 ng·mL^(-1),汉黄芩素在0.4~40 ng·mL^(-1),大黄酸在0.4~40 ng·mL^(-1),甘草酸在5~500 ng·mL^(-1)范围内线性关系良好(r>0.9985);平均加样回收率(n=6)范围均为97.0%~110.5%,RSD为3.2%~9.6%;5个批次样品中,13个成分的含量分别为栀子苷4.933~5.800 mg·g^(-1),芍药内酯苷0.104~0.123 mg·g^(-1),芍药苷3.140~4.159 mg·g^(-1),连翘酯苷A 17.40~21.05 mg·g^(-1),甘草苷0.354~0.425 mg·g^(-1),黄芩苷4.991~6.422 mg·g^(-1),连翘苷1.446~1.906 mg·g^(-1),千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷0.441~0.534 mg·g^(-1),汉黄芩苷0.925~1.138 mg·g^(-1),黄芩素0.129~0.151 mg·g^(-1),汉黄芩素0.084~0.106 mg·g^(-1),大黄酸0.051~0.063 mg·g^(-1),甘草酸0.964~1.242 mg·g^(-1)。结论:该方法特异、灵敏、高效、可靠,可用于小儿豉翘清热颗粒的质量控制。