红鳍笛鲷(♀)×千年笛鲷(♂)子一代杂种优势的微卫星标记分析

利用12对微卫星引物对红鳍笛鲷(♀)、千年笛鲷(♂)及其红鳍笛鲷(♀)×千年笛鲷(♂)子一代(F1)3个群体进行扩增,对3个群体的等位基因频率、群体多态信息含量、有效等位基因数、杂合度、Shannon信息指数及群体间遗传距离进行了遗传检测,共检测到29个等位基因,平均每个基因座位2.4167个等位基因。红鳍笛鲷、F1、千年笛鲷3个群体的多态信息含量分别为0.3484、0.5008、0.4097;有效等位基因数分别为1.9787、2.5074、2.1334;杂合度分别为0.6548、1.0000、0.7384;Shannon信息指数分别为0.6207、0.9240、0.6957。红鳍笛鲷(♀)-F1、F1-千年笛鲷(♂)、红鳍笛鲷(♀)-千年笛鲷(♂)的遗传距离分别为0.3116、0.2346、0.7813。多态信息含量、有效等位基因数、杂合度、Shannon信息指数均显示F1代有杂种优势。

红鳍笛鲷(♀)与千年笛鲷(♂)杂交F1代及其亲本的核型研究

采用胸腔活体注射PHA及秋水仙素溶液,取头肾细胞,低渗处理,空气干燥法制片,对染色体进行Giemsa染色,研究红鳍笛鲷(♀)与千年笛鲷(♂)杂交F1代及其亲本的核型。结果表明,杂交F1代及其亲本(红鳍笛鲷和千年笛鲷)的核型相同,均为2 n=48 t,NF=48,符合遗传理论。

千年笛鲷幼鱼的饥饿和补偿生长

研究了在22.5～31.9℃条件下,千年笛鲷幼鱼在不同饥饿时间(0、2、4、6、9、11d)处理后再投喂的补偿生长。千年笛鲷幼鱼的体重在短时间(2～6d)的饥饿后下降不大,9d以上的饥饿可导致幼鱼的体重明显下降。经过饥饿11d后,鱼体蛋白质含量明显下降,脂肪含量略有下降,灰分含量有所上升,水分含量明显上升,表明千年笛鲷幼鱼在饥饿过程中主要依靠消耗蛋白质作为能量来源。恢复投喂后,各组的鱼体生化组成均恢复到对照组水平。饥饿11d组鱼在恢复投喂后全部死亡,半致死时间为10～11d。结果表明:饥饿2d组的千年笛鲷幼鱼在恢复生长过程中具有超补偿生长能力,该补偿现象通过提高食物转化率达到;饥饿4d组幼鱼具有完全补偿生长能力;饥饿6d组幼鱼仅有部分补偿生长能力;饥饿9d组幼鱼不具有补偿生长能力;饥饿11d组幼鱼为饥饿致死。

消化酶活力在千年笛鲷幼鱼不同消化器官中的比较研究

测定和比较了千年笛鲷(Lutjanussebae)幼鱼不同消化器官的消化酶活性。结果表明,蛋白酶比活力为:肠>胃>肝胰脏(P<0·01);淀粉酶比活力为:肠>肝胰脏>胃(P<0·01);脂肪酶比活力为:肠>肝胰脏>胃,胃和肝胰脏间差异不显著(P>0·05),但二者和肠之间差异极显著(P<0·01)。千年笛鲷幼鱼肠道对食物的整体消化能力始终较强,肝胰脏和胃是消化食物的辅助器官。

饥饿和再投喂对千年笛鲷幼鱼消化酶活性的影响

研究了饥饿和再投喂对千年笛鲷(Lutjanus sebae)幼鱼消化酶活性的影响.实验设计分成6组,分别饥饿处理0(对照),2,4,6,9和11 d,然后在饱食的条件下恢复投喂10 d.分别测定饥饿和恢复投喂过程中千年笛鲷幼鱼蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶3种消化酶的活性.结果表明,在饥饿过程中,蛋白酶和脂肪酶活性下降明显,淀粉酶起伏较大;恢复投喂后,蛋白酶和脂肪酶活力与饥饿前相比都有所上升,但蛋白酶活力总体上仍低于同步取样对照组,脂肪酶活力总体上高于对照组水平,淀粉酶活力恢复到对照组水平,并且基本上没有变化.

千年笛鲷幼鱼耗氧率的研究

千年笛鲷幼鱼的耗氧量随幼鱼体重的增加而增加,耗氧量与体重的关系式为Y=0．756+0．513X。千年笛鲷幼鱼的耗氧率随幼鱼体重的增加而下降,耗氧率与体重的关系式为Y=1246．430X^(-0.036)。幼鱼在遮光条件下的耗氧率比在自然光照条件下要低15．362%～31．675%。在低盐度水环境下幼鱼的耗氧率较高,随着盐度的增加,其耗氧率降低。随着饥饿程度的加深,千年笛鲷幼鱼的代谢水平呈梯度下降。在盐度20和28时,千年笛鲷幼鱼的窒息点分别为0．93和1．17 mg·L^(-1)。

海水养殖优良品种——千年笛鲷池塘人工育苗技术

千年笛鲷又称儋州红、千年鲷,属暖水性底层鱼类,一般体长为40cm-60cm,全长可达800cm,重达3kg-5kg,体甚高。千年笛鲷生长速度快,活力强,育苗成活率高,是海水人工繁育鱼类中的优良品种之一。目前,海南大学海洋学院等单位开展千年笛鲷、红鳍笛鲷、紫红笛鲷人工育苗研究,以使其成为海水养殖的新品种。

千年笛鲷早期发育及视蛋白基因表达规律分析

初步观察千年笛鲷早期发育各个时期的形态特征,同时使用实时荧光定量PCR方法对4种视蛋白基因在早期发育中的表达规律进行分析。研究观察到千年笛鲷卵为圆球形,属浮性卵,中心有一明显的油球。在水温(24.5±0.5)℃的条件下,千年笛鲷胚胎发育共经历6个发育阶段18个时期,从受精卵到孵化一共经历24h。仔鱼经历12—15d发育为稚鱼,30d—35d发育为幼鱼。同时对7个胚胎发育时期和2个仔鱼发育时期4种视蛋白(LWS、SWS1、SWS2、RH)基因的表达情况进行检测,在下包1/2、胚孔封闭、视囊这3个时期有显著性表达(P<0.05),尤其在胚孔封闭时期,表达量达到最高。其余时期4种基因的表达水平显著下降,但在2个仔鱼时期表达量比孵化期略有增加。结果表明千年笛鲷4种视蛋白基因在早期表达过程中与神经胚的形成有密切的联系。

RAPD对红鳍笛鲷(♀)×千年笛鲷(♂)子一代杂种优势预测的分析

应用RAPD技术对红鳍笛鲷(♀)、千年笛鲷(♂)和红鳍笛鲷(♀)×千年笛鲷(♂)子一代3个群体的RAPD扩增带谱进行了分析,并对杂交子代F1杂种优势进行了预测。从100个随机引物中筛选出35个扩增带丰富的引物进行扩增,共得到190条清晰稳定的扩增带,其中有176个扩增位点具有多态性,多态性位点比率为92.6%。红鳍笛鲷、F1、千年笛鲷3个群体的遗传相似性指数分别为0.831 9,0.726 3,0.916 8;Nei多样性指数分别为0.174 5,0.264 0,0.118 4;Shannon信息指数分别为0.256 4,0.384 5,0.171 2。红鳍笛鲷(♀)-F1,F1-千年笛鲷(♂),红鳍笛鲷(♀)-千年笛鲷(♂)的遗传距离分别为0.397 2,0.317 0,0.854 1。从相似性指数、Nei多样性指数和Shannon信息指数均显示F1代有杂种优势,并找到了种间特异性标记。

千年笛鲷染色体核型研究

采用活体分离鱼的肾细胞,与PHA、秋水仙碱相作用、经Giemsa染色、空气干燥法制片,对千年笛鲷(Lutjanus sebae)的染色体核型进行分析.结果表明千年笛鲷染色体数目2n=48,核型公式为2N=46t+2sm,NF=50.本方法简便、容易重复、适用于其它鱼类染色体核型的研究.

杂交笛鲷人工繁育技术的初步研究

红鳍侑鲷（♀，40尾）×千年笛鲷（♂，45尾）杂交，得到受精卵2．2kg，浮卵率为78．57％，受精卵的孵化率为90．51％，共得到健康仔鱼349．2万尾；千年笛鲷（♀，30尾）×红鳍笛鲷（♂，28尾）的杂交，不成功。在水温27．5～33．5℃、盐度27．5～32．5、pH7．6～8．3、溶解氧4～6mg／L条件下，杂交笛鲷仔鱼经过32d的培育，用3个育苗池塘（面积共0．933hm^2）培育出平均全长36．8mm的幼鱼44．4万尾，单位面积培育鱼种47．57万尾／hm^2，育苗成活率为8．95％。

6种笛鲷属鱼类Cyt b基因片段序列的比较

采用聚合酶链式反应直接测序法,获得紫红笛鲷(Lutjanusargentimaculatus)、白星笛鲷(L.stellatus)、千年笛鲷(L.sebae)、勒氏笛鲷(L.russelli)、红鳍笛鲷(L.erythropterus)5种笛鲷属鱼的线粒体细胞色素b(Cytb)425bp序列,并结合基因库中的斜带笛鲷(L.decussatus)Cytb同源序列进行比较分析,共发现88个核苷酸位点存在变异(20.7%)。用MEGA2.1软件中的Pairwisedistance工具计算了6种笛鲷属鱼类的相对遗传距离,表明6种笛鲷属鱼类的序列差异在0.096—0.129之间,其中红鳍笛鲷和紫红笛鲷序列差异最大为0.129,千年笛鲷与红鳍笛鲷的序列差异最小为0.096;序列变异的转换/颠换比值较低,平均只有2.160。

9种常见笛鲷微卫星位点筛选与遗传多样性分析

利用从勒氏笛鲷Lutjanus russelli基因组文库中筛选得到37对微卫星引物对笛鲷属9个习见种红鳍笛鲷L.erythropterus、紫红笛鲷L.argentimaculatus、星点笛鲷L.stellatus、约氏笛鲷L.johnii、千年笛鲷L.sebae、金带笛鲷L.fulvus、金焰笛鲷L.fulviflamma、画眉笛鲷L.vitta与奥氏笛鲷L.ophuysenii的微卫星位点进行筛选和分析。9个种都能检测到的微卫星位点有10个,部分种能检测到的有13个。9种笛鲷Hardy–Weinberg平衡下的平均期望杂合度在0.730―1.000,平均观测杂合度在0.716―0.915,偏离指数(D)为-0.002―-0.214。微卫星位点杂合度的分析表明目前笛鲷属鱼类存在较高的遗传多样性水平。另发现9个种的笛鲷都出现了杂合子缺失的情况,缺失的原因有待于进一步的研究予以解释。

红鳍笛鲷亲鱼培育及产卵技术研究

采用控温、营养强化的方法培育红鳍笛鲷(Lutjanuserythropterus)亲鱼 ,并结合激素诱导使其在1周年内每个月不间断产卵。实验亲鱼454尾 ,培育成活率为96% ,共采卵147150×104粒 ,平均每尾雌鱼年产卵量为541.0×104粒 ,人工催产卵的受精率为40 %～86.2 % ,自然产卵的受精率为68.3%～91.2%。

川纹笛鲷染色体核型、银染和C-带

实验采用植物血凝素、秋水仙碱腹腔注射,肾细胞直接制片法分析了川纹笛鲷Lutjanus sebae染色体核型、Ag-NORs和C-带。结果表明:1)川纹笛鲷二倍体染色体数2n=48,核型公式为:2n=48t,NF=48;在第1对染色体靠近着丝粒部位有明显的次缢痕。2)染色体经快速银染后,Ag-NORs的数目在不同细胞中表现出多态性,数目1—4个,2个Ag-NORs的频率最高(占79%)。在分裂相中,第1对t染色体近着丝粒的次缢痕区均出现2个银染位点(Ag-NORs阳性),且未见Ag-NORs的联合现象。3)大多数染色体的着丝粒区显示出1个深浅不同的C-带,在第1对染色体的随体区域分布有大量的结构异染色质,表现C-带强阳性。讨论了鱼类核型演化规律和Ag-NORs、C-带的发生机制,以及川纹笛鲷的进化地位。

川纹笛鲷消化道优势菌群PCR-DGGE指纹图谱比较分析

采用免培养的16S rDNA梯度凝胶电泳技术(DGGE)对集约化海水网箱养殖川纹笛鲷(Lutjanus sebae)的消化道胃壁、胃内容物、肠壁、肠内容物优势菌群结构进行了比较分析。研究结果显示,川纹笛鲷消化道存在着丰富多样的细菌群落,对DGGE指纹图谱聚类分析表明菌群组成相似度高于55%,其中胃内容物及胃壁细菌组成相似度最高(90%),这可能与摄食饵料在消化道推移有关;而胃壁与肠壁相似度相对最差,可能反应了由于生理环境不同引起的宿主差异性。通过建立川纹笛鲷消化道16SrDNA-DGGE指纹图谱及比较分析,为澄清川纹笛鲷消化道微生物区系奠定了基础。

红鳍笛鲷外周血细胞的显微结构观察

报道了红鳍笛鲷(Lutjanus erythopterus)外周血细胞的显微结构,血涂片经过Wright染色液染色,可区分出:红血细胞、血栓细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等5种血细胞,无嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞。白血细胞中:血栓细胞体积最小,单核细胞体积最大;血栓细胞数目最多,嗜中性粒细胞和单核细胞数目最少;淋巴细胞有大中小3种类型:大淋巴细胞、中淋巴细胞和小淋巴细胞。此外,在外周血液中还观察到少量幼稚的红细胞,偶而可见正在分裂的红细胞,提示红细胞也可在外周血直接分裂。

4种笛鲷属鱼类mtDNA的RFLP研究

用RFLP(限制性片段长度多态性,Restriction fragment length polymorphism)技术研究了红鳍笛鲷Lutjanus erythropterus Bloch、紫红笛鲷Lutjanus argentimaculatus Forskal、勒氏笛鲷Lutja-nus russelli Bleeker和约氏笛鲷Lutjanus johni Bloch的遗传多样性关系,检测到4种笛鲷的分子标记。通过差速离心、核酸酶消化、苯酚抽提,从4种笛鲷肝脏组织中分离纯化线粒体DNA(mtDNA),用19种5到6碱基对的限制性内切酶进行单酶、双酶和部分酶切,琼脂糖凝胶电泳,进行了RFLP分析,构建了4种笛鲷mtDNA的物理图谱。红鳍笛鲷、紫红笛鲷、勒氏笛鲷和约氏笛鲷的mtDNA大小分别为17.36±0.09kb、17.58±0.08kb、17.50±0.18kb和17.56±0.12kb。红鳍笛鲷和紫红笛鲷种群间平均mtDNA多态度π为0.106 2,红鳍笛鲷和勒氏笛鲷群体间平均mtDNA多态度π为0.130 5,红鳍笛鲷和约氏笛鲷群体间平均mtDNA多态度π为0.151 5,紫红笛鲷和勒氏笛鲷群体间平均mtD-NA多态度π为0.130 3,紫红笛鲷和约氏笛鲷群体间平均mtDNA多态度π为0.119 5,勒氏笛鲷和约氏笛鲷群体间平均mtDNA多态度π为0.139 4。红鳍笛鲷和紫红笛鲷种群间净遗传距离Pnet为0.102 0,红鳍笛鲷和勒氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.128 5,红鳍笛鲷和约氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.149 1,紫红笛鲷和勒氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.127 0,紫红笛鲷和约氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.115 7,勒氏笛鲷和约氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.137 8。

紫红笛鲷线粒体全序列与笛鲷属鱼类分化年代的贝叶斯分析

利用常规PCR未纯化产物直接测序的方法,获得紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)全长为16 543 bp线粒体DNA全序列,GenBank登录号为JN182927。结合GenBank中的已有数据比较分析表明:紫红笛鲷与笛鲷属(Lutjanus)线粒体基因组成基本一致,符合脊椎动物的特征,各基因间进化速率差异显著;13个蛋白编码基因拼接序列贝叶斯建树的后验率显著高于单基因或全序列,更适用于笛鲷属的贝叶斯法系统分化分析和年代推断;13个蛋白编码基因及其拼接序列进行的系统进化分析均支持紫红笛鲷与勒氏笛鲷(Lutjanus russellii)及海鸡母笛鲷(Lutjanus rivulatus)亲缘关系较近;基于13个蛋白编码基因拼接序列的贝叶斯松散分子钟推算出笛鲷属鱼类两个主要支系大约在61.5Ma前古新世的达宁阶与蒙蒂阶交界时期发生分化。