千里光菲灵碱诱导MEK/ERK1/2介导的宫颈癌细胞自噬效应

探讨千里光菲灵碱对人宫颈癌He La、Caski细胞增殖、自噬的影响及其可能的作用机制。MTT法检测千里光菲灵碱对He La、Caski细胞增殖的影响;免疫荧光法检测GFP-LC3/He La和GFP-LC3/Caski两种细胞内自噬体的形成情况;免疫印迹法检测千里光菲灵碱对自噬相关蛋白表达的影响;荧光共定位法检测自噬体与溶酶体的融合情况;建立荷宫颈癌He La、Caski细胞移植瘤裸鼠模型,检测千里光菲灵碱对移植瘤生长的抑制作用。结果显示,千里光菲灵碱呈时间和剂量依赖性抑制He La、Caski两种宫颈癌细胞的增殖;千里光菲灵碱可诱导He La、Caski细胞内自噬体的形成和LC3-II蛋白的增加及P62蛋白的减少,表明千里光菲灵碱可诱导He La、Caski细胞发生自噬;与单药千里光菲灵碱相比,千里光菲灵碱联合自噬下游抑制剂氯喹(CQ)显著增加了LC3-II及P62的蛋白表达,同时荧光共定位显示千里光菲灵碱诱导的自噬体可与溶酶体实现共定位,表明千里光菲灵碱可诱导完整自噬流;与单药千里光菲灵碱相比,千里光菲灵碱联合自噬上游抑制3-甲基腺嘌呤(3MA)剂显著增加了LC3-II的蛋白表达,显著降低了He La、Caski细胞的存活率,表明抑制自噬可增强千里光菲灵碱对宫颈癌细胞增殖的抑制作用;与单药千里光菲灵碱相比,千里光菲灵碱联合MEK抑制剂显著降低了P-ERK1/2的蛋白表达,减少了自噬体的形成,表明千里光菲灵碱诱导的He La、Caski细胞自噬依赖于MEK/ERK1/2途径;另外,千里光菲灵碱可显著抑制宫颈癌细胞裸鼠皮下移植瘤的生长。

HPLC-MS/MS法测定不同产地千里光中千里光菲灵碱的含量

[目的]测定不同产地11批千里光中千里光菲灵碱的含量。[方法]采用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)法进行检测。色谱柱为ACE Excel 3 C_(18)-PFP(4.6 mm×150 mm,3μm),流动相为0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水,梯度洗脱;柱温40℃,流速0.6 mL/min;质谱采用电喷雾(ESI)离子源,正离子模式,多反应监测(MRM)的扫描方式进行检测。[结果]该方法线性关系良好,精密度、重复性和稳定性良好,加样回收率在96.90%~102.13%,RSD为1.16%~1.48%,该方法符合方法学考察要求;11批千里光药材中千里光菲灵碱含量为0.0696~0.8111μg/g。[结论]该研究建立的方法稳定可行,可用于千里光中千里光菲灵碱含量的测定,为中药千里光的质量控制提供新参考。

彝药菊三七的质量标准及不同产地药材的质量评价

目的 完善并提高彝药菊三七的质量标准,并评价其质量。方法 以不同产地的15批菊三七药材为样品,根据2020年版《中国药典》(四部)方法测定其水分、总灰分、酸不溶性灰分及水溶性浸出物含量,采用紫外分光光度法测定其总生物碱(以千里光碱计)含量,采用高效液相色谱(HPLC)法测定其千里光碱和千里光菲灵碱含量。以上述7个指标为评价指标,通过聚类热图分析法、主成分分析(PCA)法及熵权逼近理想排序(TOPSIS)法对药材质量进行综合评价。结果 15批菊三七的水分含量为8.88%~12.60%,总灰分含量为4.43%~11.02%,酸不溶性灰分含量为0.56%~3.45%,水溶性浸出物含量为21.71%~53.91%,总生物碱(以千里光碱计)含量为0.15%~0.39%,千里光碱、千里光菲灵碱的含量分别为0.01%~0.05%、0.01%~0.06%。根据各指标结果,初步拟定菊三七样品中水分不得过13.00%,总灰分不得过11.50%,酸不溶性灰分不得过3.70%,水溶性浸出物含量不得少于20.70%,总生物碱含量(以千里光碱计)不得少于0.15%,千里光碱、千里光菲灵碱含量均不得少于0.01%。聚类热图分析结果显示,15批样品可分为4类;PCA法和TOPSIS法分析结果显示,品质排名靠前的样品为jsq-2、jsq-5、jsq-6、jsq-10,品质排名靠后的样品为jsq-4、jsq-13、jsq-14。结论 本研究建立了菊三七中总生物碱(以千里光碱计)、千里光碱、千里光菲灵碱的定量分析方法,并初步拟定了各指标的限度;在15批样品中,以产自凉山彝族自治州甘洛县林杂村、凉山彝族自治州普格县螺髻山镇马厂坪村等地的样品质量相对较好。

千里光对小鼠体外培养胚胎的胚胎毒性研究

为了探讨千里光的胚胎发育毒性,采用小鼠全胚胎培养模型,将8.5天小鼠胚胎从母体分离后,在含有千里光单体成分千里光菲灵碱和克氏千里光碱的即刻离心血清中培养48 h(千里光菲灵碱的终质量浓度分别为12.5、25、50和100μg·mL-1,克氏千里光碱的终质量浓度分别为12.5、25和50μg·mL-1),观察千里光菲灵碱和克氏千里光碱对胚胎生长发育和组织器官形态分化的影响。结果表明,千里光菲灵碱和克氏千里光碱对胚胎的生长发育和形态分化均具有毒性影响,其毒性具有一定的剂量相关性。千里光所含生物碱成分对体外培养的小鼠胚胎有明显的毒性作用,提示妊娠期暴露于千里光对胎儿具有潜在的毒性。