升麻鳖甲汤加减方对人急性髓系白血病细胞诱导脐静脉内皮细胞迁移、趋化、管腔形成的影响

目的研究升麻鳖甲汤加减方在体外对人急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞株HL-60以及人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖的影响;随后以人急性髓系白血病细胞HL-60的培养上清对人脐静脉内皮细胞HUVEC进行诱导培养,并加入不同浓度的升麻鳖甲汤加减方进行干预,检测人脐静脉内皮细胞HUVEC迁移、趋化、管腔形成能力的变化,从而揭示升麻鳖甲汤加减方对人急性髓系白血病细胞诱导的脐静脉内皮细胞迁移、趋化、管腔形成的影响。方法体外培养HL-60以及HUVEC细胞,待细胞进入对数生长期后进行相应实验;首先将不同浓度升麻鳖甲汤加减方在体外分别用于干预人急性髓系白血病细胞HL-60和人脐静脉内皮细胞HUVEC,在干预时间达48 h后,采用MTT法分别检测不同浓度升麻鳖甲汤加减方对HL-60以及HUVEC细胞增殖能力的影响;根据MTT实验的数据提示,选择适宜终浓度的升麻鳖甲汤加减方与HL-60细胞培养上清进行混合制备含药条件培养基用于干预HUVEC细胞,并分别运用划痕迁移、Transwell小室趋化以及Matrigel胶小管形成等实验方法观察HUVEC细胞经干预后的迁移、趋化效应以及成管能力的变化。结果不同浓度的升麻鳖甲汤加减方干预48 h后能够分别显著抑制HL-60以及HUVEC细胞的增殖(P<0.01),并且这种增殖抑制效应呈现出明显的时间-浓度依赖性,并且在HL-60和HUVEC两种细胞之间存在差异性细胞毒作用,即对HUVEC细胞的增殖抑制显著高于HL-60细胞(P<0.01);不同终浓度的升麻鳖甲汤加减方对由HL-60细胞上清诱导培养的HUVEC细胞的迁移运动能力均有不同程度的抑制作用(P<0.05),并且细胞迁移率随着药物浓度的增加而下降;细胞Transwell小室趋化实验结果显示,不同终浓度的升麻鳖甲汤加减方可显著降低HL-60细胞上清诱导培养的HUVEC细胞的趋化性(P<0.05);HUVEC细胞小管形成连接点、分支数量等均明显低于阳性对照组(P<0.01),小管形成抑制率随着药物浓度的增加而上升,且HUVEC细胞生成小管的连接点及分支数量与药物浓度呈负相关(P<0.01)。结论升麻鳖甲汤加减方可抑制HL-60及HUVEC细胞的增殖,并存在差异细胞毒作用,提示该复方可能具有抑制急性髓系白血病肿瘤血管形成的效应,而这种效应的产生可能与其抑制肿瘤血管内皮细胞的迁移、趋化及成管能力等相关。

升麻鳖甲汤加减方对人急性髓系白血病HL-60细胞增殖、凋亡及MAPK信号通路相关蛋白表达的影响

目的探讨升麻鳖甲汤加减方治疗急性髓系白血病的可能机制。方法采用MTT法观察0、2、4、6、8、10mg/ml浓度的升麻鳖甲汤加减方干预HL-60细胞24h、48h、72h时细胞增殖抑制率,筛选最佳实验时间和药物浓度。取对数生长期HL-60细胞5×10~5个/ml,按每孔2ml体积种入6孔培养板中。分别加入筛选浓度的升麻鳖甲汤加减方设为升麻鳖甲汤加减方低、中、高剂量组,另设对照组加入等体积完全培养基,继续培养筛选得出的最佳实验时间后收集各组细胞。采用Heochest 33258染色、流式细胞术观察各组细胞凋亡率,检测细胞周期分布、线粒体膜电位及细胞凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(caspase-8)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(caspase-9)、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)表达,MAPK信号通路相关蛋白p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白表达。结果筛选得出24h为最佳作用时间,升麻鳖甲汤加减方高、中、低剂量组干预浓度分别为4、6、8mg/ml。升麻鳖甲汤加减方各剂量组均不同程度抑制人急性髓系白血病细胞HL-60增殖(P<0.05);Heochest 33258染色和Annexin V/PI检测结果均显示,升麻鳖甲汤加减方各剂量组可呈浓度依赖性的增加细胞凋亡率,同时升高线粒体膜电位(P<0.05);升麻鳖甲汤加减方各剂量组可呈浓度依赖性阻滞细胞周期升高凋亡相关蛋白表达以及MAPK信号通路相关蛋白水平(P<0.05)。结论升麻鳖甲汤加减方可通过阻滞HL-60细胞细胞周期、诱导其线粒体膜电位的丢失引发细胞凋亡,从而抑制其增殖,可能与调控MAPK信号通路有关。