猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶和脱氢抗坏血酸还原酶cDNA片段的克隆与序列分析

克隆猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因,可为揭示猕猴桃高抗坏血酸(AsA)含量的分子机制奠定基础。研究以猕猴桃果实为材料提取总RNA,采用RT-PCR法,克隆出L-GalLDH基因的cDNA片段857 bp和DHAR基因的cDNA片段594 bp并测序,根据测序结果推测其氨基酸序列,并与刺梨、拟南芥、花椰菜、甘薯和草莓等植物的GalLDH基因和DHAR基因氨基酸序列进行亲缘分析。结果表明,猕猴桃GalLDH基因氨基酸序列和核苷酸序列与刺梨的相似性高达88%,其在同源基因进化关系树中单独聚为一类;DHAR基因氨基酸序列和核苷酸序列与苹果的相似性高达98%和99%,两者在进化关系上聚为一类。可知克隆到的2个核苷酸片段确为猕猴桃L-GalLDH和DHAR基因cDNA片段,同源基因植物亲缘关系聚类与传统的形态分类有一定的差异。

水稻L-半乳糖内酯脱氢酶基因的克隆和原核表达及抗体的制备

应用RT-PCR技术从水稻叶片中克隆了水稻L-半乳糖内酯脱氢酶(GLDH)的全长基因.序列分析表明,水稻GLDH基因全长1752bp,亚克隆其部分成熟蛋白编码基因(789bp),利用基因重组技术构建了E.coli/pET30a-GLDHe,经酶切鉴定,DNA测序,证实重组质粒构建正确;将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析证实表达出相对分子质量约为36000的蛋白.用原核表达蛋白作为抗原免疫家兔制备抗体,用Westernblot检测抗体的特异性及效价,结果表明,抗体血清效价为1∶1000,在加IPTG诱导后的菌液中可以检测到相应的蛋白条带((相对分子质量为36000)),在水稻叶片样品中能检测到1条相对分子质量为36000的蛋白条带.

刺梨半乳糖内酯脱氢酶的序列特征和部分反应特性

分析和研究了从刺梨中克隆的维生素C合成关键酶半乳糖内酯脱氢酶的氨基酸序列特征及其基本生化反应特性.结果表明,该基因含有一段线粒体靶信号肽序列、2个跨膜区、一个典型的FAD结合域以及1个天冬酰胺糖基化位点、8个蛋白激酶C磷酸化位点、11个酪蛋白激酶2磷酸化位点、2个酪氨酸激酶磷酸化位点和4个N端十四(烷)酰化位点等潜在功能性或翻译后修饰位点.丫啶黄素显著抑制GalLDH活性,二价金属盐CuSO4和ZnSO4有部分抑制作用,而石蒜碱几乎没有作用.

毛花猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶基因cDNA片段的克隆与序列分析

毛花猕猴桃果实中Vc含量极高,为了揭示毛花猕猴桃Vc形成规律,根据已知植物的L-半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)基因,设计简并引物,以毛花猕猴桃新品种‘华特’果实为材料提取总RNA,采用RT-PCR法,克隆出一条长661 bp的cDNA片段,根据测序结果推测其氨基酸序列,并与刺梨、拟南芥、甘薯和草莓等植物的GalLDH基因编码的氨基酸序列进行亲缘分析。结果表明,所克隆片段编码氨基酸序列与美味猕猴桃GalLDH相似度高达99%,其在同源基因进化关系上聚为一类,与葡萄的GalLDH相似性高达91%,与草莓、刺梨、甘薯、温州蜜柑、拟南芥、甜瓜等植物的GalLDH同源性均在80%以上,可知克隆到的核苷酸片段确为毛花猕猴桃GalLDH基因的cDNA片段。

软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因的克隆及原核表达分析

为更好了解L-半乳糖内酯脱氢酶及编码基因在软枣猕猴桃中的生理功能及作用,以‘魁绿’软枣猕猴桃果实cDNA为模板,用RT-PCR及RACE技术,获得L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶基因AaGalLDH(GenBank:KP145007.1)。序列分析表明该基因全长为2394 bp,开放阅读框为1833 bp,编码610个氨基酸,与其它植物GalLDH氨基酸序列具有78%~95%的同源性。编码的蛋白序列具有GalLDH蛋白家族典型的保守结构域。进一步将该基因连接到原核表达载体并转化大肠杆菌进行诱导表达,经Western Blotting验证,目的基因在pET-28a表达系统中有表达,但基本为不溶性表达。这为进一步研究该酶蛋白的体外表达和功能以及选育高品质软枣猕猴桃品种奠定了基础。

刺梨半乳糖内酯脱氢酶的酶促反应条件优化

为进一步探明刺梨半乳糖内酯脱氢酶（GalLDH）的作用机理及其对维生素C（AsA）合成效率的影响,以高AsA果实刺梨为材料,研究了AsA合成关键酶——GalLDH酶促反应的动力学参数。结果表明,刺梨GalLDH反应的最适温度在30℃左右,最适pH值为8.3-9.4,以半乳糖内酯作为反应底物的Km为0.031 mM,最大反应速率Vmax=0.026 U/s。当以古洛糖内酯作为反应底物时,GalLDH也能表现约70%的活性。

植物抗坏血酸合成的关键酶:L-半乳糖内酯脱氢酶(GLDH)

本文从酶的催化反应、酶学特征、分子生物学特性等方面介绍植物抗坏血酸合成的关键酶L-半乳糖内酯脱氢酶的研究进展。

枸杞L-半乳糖酸内酯脱氢酶基因的克隆及表达分析

以青海枸杞（Lycium barbarum L.）为模板,采用RT-PCR和RACE技术,克隆枸杞L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶（GLDH）基因序列,命名为LbGLDH。LbGLDH基因全长为2 114bp,包含一个开放读码框1 767bp（编码588个氨基酸）、5′末端序列57bp、3′末端序列290bp。LbGLDH基因核苷酸序列与番茄、马铃薯、烟草GLDH基因具有88%～90%的一致性。LbGLDH编码氨基酸序列包含GLDH蛋白酶具备的FAD-binding-4和ALO结构域。qRT-PCR分析结果显示,在枸杞不同组织中LbGLDH基因的表达、抗坏血酸含量和GLDH活性变化趋势相同,表现为在枸杞的花和果实中表达量最高,成熟叶中表达量最少。推测LbGLDH基因表达促进枸杞果实中抗环血酸含量的积累。

黄瓜L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶cDNA全长的克隆和遗传转化

以黄瓜D08108果实为材料,根据GenBank中登录的甜瓜L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶(GalLDH)的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出黄瓜GalLDH的cDNA全长,GenBank登录号为HQ446099。黄瓜GalLDH的cDNA序列全长1 880 bp,包含一个长为1 773 bp的完整开放阅读框,编码590个氨基酸。其核苷酸序列与已知其他植物核苷酸序列间的同源性达70%以上。共检测得到5棵转基因植株。

柑橘L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因的克隆

利用同源序列法结合电子克隆技术,从温州蜜柑幼果中克隆到长度为2 111 bp的L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因(citGalLDH),GenBank登录号为FJ849840。生物信息分析表明该基因包含一个1 818 bp的开放阅读框,编码605个氨基酸,分子质量为68 628.63 u,等电点为8.727;柑橘GalLDH蛋白具备FAD_binding_4和ALO结构域,与杨树和拟南芥GalLDH蛋白的关系较近。所克隆的citGalLDH可为深入研究柑橘Vc合成分子机制奠定基础。

刺梨果实中维生素C积累与相关酶活性的关系

刺梨果实发育过程中维生素C(AsA)积累呈“慢—快—慢”的模式,其中6月底至8月初是AsA积累最快和最重要的时期。半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)活性与AsA积累速率的变化趋势基本一致,二者间呈极显著的正相关关系。AsA分解酶抗坏血酸氧化酶(AAO)和抗坏血酸过氧化物酶(AAP)只在发育前期极短时间内表现活性,从而使AsA极少被氧化分解,这是刺梨果实能积累高水平AsA的重要原因之一;在果实发育过程中始终未能检测到单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)的活性,表明它们不是刺梨果实积累高含量AsA的关键因素。

不同蔬菜产品器官抗坏血酸含量与其相关酶活性的关系

以抗坏血酸(AsA)含量差异较大的甜椒、番茄、马铃薯、萝卜和黄瓜的产品器官为试材,研究不同发育期产品器官AsA含量与其相关酶活性的关系。结果表明,5种蔬菜不同发育期产品器官AsA含量与DHAR和GalLDH活性变化趋势基本一致。以5种蔬菜产品器官形成末期AsA含量与其相关酶活性的相关性分析得知,AsA含量与DHAR活性呈显著正相关(r=0.9423,P<0.05),与GalLDH活性的相关性也较显著(r=0.8597,P<0.10);AsA+DHA含量与GalLDH活性相关性明显(r=0.7904,P<0.15)。AsA含量与MDHAR、AAO和APX活性无显著相关性。这说明不同物种蔬菜产品器官AsA含量存在较大差异的原因与其GalLDH和DHAR活性存在较大差异密切相关,MDHAR、AAO和APX活性不是影响AsA含量的主要因素。

和田密植红枣果实发育中高维生素C积累与相关酶活性及独特环境协同作用的关系

对4个和田红枣品种果实发育过程中维生素C含量和半乳糖内酯脱氢酶、抗坏血酸氧化酶、抗坏血酸过氧化物酶、单脱氢抗坏血酸还原酶、脱氢抗坏血酸还原酶的活性以及果实鲜干质量和糖积累进行测试分析,结果显示,维生素C含量的积累在发育过程中呈"S"形的模式,其中120、140 d是维生素C积累最快和最重要的2个时期。半乳糖内酯脱氢酶活性与维生素C积累速率及糖的变化趋势相似,二者在60～120 d呈明显的线性正相关关系。维生素C分解酶抗坏血酸氧化酶和抗坏血酸过氧化物酶只在发育前期短时间内表现活性,从而使维生素C极少被氧化分解,这是枣果实能积累高水平维生素C的重要原因;单脱氢抗坏血酸还原酶和脱氢抗坏血酸还原酶的活性则主要表现在生育后期,结果显示,3个制干枣品种中维生素C含量主要受半乳糖内酯脱氢酶活性调节,同时维生素C代谢酶抗坏血酸氧化酶也对维生素C积累起到了重要作用,而单脱氢抗坏血酸还原酶和脱氢抗坏血酸还原酶活性对维生素C积累的作用主要在生长晚期,制干品种生育期比鲜食品种延长55～65 d,果实成熟采收期比其他区域延迟30～45 d,此时制干枣品种果实维生素C积累明显高于鲜食枣品种。

沙棘维生素C积累与相关酶活性关系研究

探讨沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.)不同器官中抗坏血酸(As A)积累与相关代谢酶活性的关系。结果表明,As A在沙棘幼叶和果实中含量较高,在茎和花中含量较低。沙棘幼叶和果实中As A含量主要受L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶(Gal LDH)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性调节,抗坏血酸氧化酶(AAO)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)对As A的积累也有调节作用。

不同叶龄菠菜叶片抗坏血酸含量与其代谢相关酶活性的比较

以欧丽特菠菜叶片为试材,研究了菠菜叶片发育过程中3个时期叶片(幼叶、成熟叶、衰老叶)的抗坏血酸代谢变化及抗坏血酸含量与其相关酶活性的关系。结果表明:抗坏血酸(AsA)和氧化型抗坏血酸(DHA)含量的变化趋势与L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶(GalLDH)以及脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性的变化趋势基本一致,而与抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性变化呈此消彼长。同时单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、谷胱甘肽还原酶(GR)和还原型谷胱甘肽(GSH)有助于AsA的再生。说明通过增加GalLDH和再生酶活性能提高菠菜叶片AsA的含量,并延缓其衰老。

外源Ca^(2+)、Mg^(2+)、Cu^(2+)和吖啶黄素对刺梨果实维生素C合成的影响

【目的】研究二价金属离子和传统抑制剂对刺梨果实维生素C合成的调控作用。【方法】以‘贵农5号’刺梨为材料,采用离体喂饲和活体注射相结合的方法,研究Ca2+、Mg2+、Cu2+等二价金属离子及吖啶黄素、石蒜碱等有机抑制剂对刺梨果实半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)活性和维生素C(AsA)合成的影响。【结果】Ca2+、Mg2+两种离子对初纯化的GalLDH酶活性有一定的促进作用,Cu2+则显著抑制其活性;当用金属离子与AsA合成底物半乳糖内酯(GalL)共同喂饲果肉时,Ca2+、Mg2+两种离子未有效促进AsA合成,Cu2+处理下的刺梨果肉中AsA含量甚至显著降低;在刺梨果实发育过程中,注射Ca2+对活体果实AsA合成有明显促进作用,Mg2+的作用不明显,而Cu2+依然表现出对AsA合成的抑制作用。吖啶黄素能抑制初纯化GalLDH酶液约70%的活性,而石蒜碱的抑制作用较小(约30%),但两者在离体喂饲处理中对AsA合成表现出相似的抑制效果;活体注射处理时,吖啶黄素在处理后期对AsA合成表现出较明显的抑制作用,石蒜碱则无此效应。【结论】外源增Ca2+可促进刺梨果实AsA合成和积累,而Cu2+和吖啶黄素则有抑制作用。

外源ABA对GalLDH超表达转基因水稻种子萌发和生理指标的影响

采用5 μmol·L^-1的脱落酸(ABA)溶液对GalLDH(L-半乳糖内酯脱氢酶)基因超表达转基因水稻(GO-2)和粳稻野生型品种中花11(WT)的去壳种子进行处理,研究外源ABA对GO-2和WT种子萌发过程中抗坏血酸(AsA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性以及种子萌发率的影响。结果表明:正常培养条件下,GO-2种子的内源AsA含量在萌发前期比WT提高了16%,在萌发中后期提高了35%,差异显著,萌发率也高于WT。另外,ABA处理对处于萌发前期的WT种子抑制作用更为明显,说明内源AsA含量与水稻种子萌发密切相关,内源AsA含量的提高可能打破了种子萌发相关的激素之间的平衡,提高了种子的萌发率。此外,在种子萌发过程中,GO-2和WT的SOD和POD活性变化以及对外源ABA的响应存在差异,充分说明内源AsA与抗氧化酶系统共同参与调控水稻种子的萌发,进一步证实了内源AsA在水稻种子活力保持以及种子萌发中的重要作用。

GLDH超表达水稻愈伤组织的耐盐性研究

为了探讨内源抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)水平对水稻愈伤组织耐盐性的影响,以AsA合成关键酶半乳糖内酯脱氢酶(L-galactono-1,4-lactonedehy drogenase,GLDH)基因超表达型水稻(GO)为材料,研究了盐胁迫(1%NaCl)下GO愈伤组织继代生长及相关抗性生理指标的动态变化。结果表明,盐胁迫下GO愈伤组织生长明显优于野生型(wildtype,WT),表现为生长速率较快,愈伤颗粒较大,致密,呈浅黄色。盐胁迫下GO愈伤组织中还原型AsA与总AsA含量不断下降,DHA含量总体上也呈下降趋势,但其氧化还原势(AsA/DHA)在胁迫初期上升,后期快速下降。进一步研究发现盐胁迫下GO愈伤组织中MDA含量先上升后快速下降,但其含量显著低于WT,而POD活性在胁迫初期略有降低,在后期又快速升高,其活性总体上显著高于对照。因此上述研究表明GLDH超表达水稻愈伤组织的耐盐性增强与其AsA含量提高有关。

苹果叶片离体衰老过程中抗坏血酸代谢的变化

以苹果(M a lus d om estica Borkh)品种嘎拉(G a la)秋梢成熟叶片为试材,在水培养条件下,研究了离体苹果叶片衰老过程(0,6,12,18,30,48和72 h)中抗坏血酸-谷胱甘肽(A SA-G SH)循环及A SA合成关键酶L-半乳糖-γ-内酯脱氢酶(G a lLDH)的变化。结果表明,在整个衰老过程中,伴随H2O2含量、质膜相对透性和M DA含量升高,离体苹果叶片中单脱氢抗坏血酸还原酶(M DHAR)活性下降,抗坏血酸过氧化物酶(APX)和脱氢抗坏血酸还原酶(DAHR)活性分别在18和30 h达到最高值,而后开始下降。G a lLDH对苹果叶片离体衰老反应迅速,在6 h活性达到最高,而后开始迅速下降。A SA/DHA,总A SA和总G SH含量随离体培养时间的延续均先上升而后下降,而G SH/G SSG比值在叶片离体衰老过程中一直下降。说明在苹果叶片离体衰老过程中,抗氧化剂A SA代谢主要是通过提高DHAR活性来维持其高水平,抵制衰老。