半乳糖基化壳聚糖-聚乙烯亚胺递送siRNA对肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu中MRE11表达的影响

背景:壳聚糖是一种常用的非病毒载体,具有良好生物相容性、生物可降解性、低毒等优点,但其基因递送能力相对较弱,常需要进行结构衍生修饰。目的:观察半乳糖基化壳聚糖-聚乙烯亚胺(LA-CS-PEI)在肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu中递送si RNA的能力及对减数分裂重组蛋白11(MRE11)表达的影响。方法:1将肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu或人肝细胞HL-7702分别与0,10,20,40,80,100 mg/L的LA-CS-PEI或壳聚糖-聚乙烯亚胺共培养24 h,检测细胞存活率;2将LA-CS-PEI与si RNA-FAM分别以0,2,4,8,16,32的质量比混合,制备复合转染颗粒。以复合转染颗粒转染肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu,48,72,96 h后,以转染效率筛选最佳质量比与转染时间,进行下步实验;3以复合转染颗粒、LA-CS-PEI、si RNA分别转染肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu 48 h后,以未转染的细胞为空白对照,检测MRE11基因及蛋白的表达。结果与结论:1与壳聚糖-聚乙烯亚胺相比,LA-CS-PEI毒性更低,且当LA-CS-PEI质量浓度高达100 mg/L时,仍表现出很低的细胞毒性;2LA-CS-PEI与si RNA-FAM质量比为4和8时转染效率均达95%以上,入胞效率极高,转染48 h转染效果最好,所以后续实验选择质量比为8,转染时间为48 h的复合转染颗粒;3复合转染颗粒组MRE11基因及蛋白表达低于LA-CS-PEI组、si RNA组、空白对照组(P<0.05);4结果表明,LA-CS-PEI能实现si RNA的有效递送,并能沉默肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu中的MRE11基因。

半乳糖化壳聚糖-低分子聚乙烯亚胺/DNA复合物的肝靶向性研究(英文)

目的：研究半乳糖化壳聚糖-低分子聚乙烯亚胺（galactosylated chitosan-graft-polyethyleneimine,GC-PEI）/DNA复合物在体内外的肝靶向性。方法：GC-PEI与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescentprotein,EGFP）质粒（pEGFP-Cl）在0.01 mol/L PBS,150 mmol/L NaCl,5%葡萄糖溶液中自组装成3种不同溶媒介导的GC-PEI/DNA复合物,检测复合物粒径大小与形态,Zeta电位以及结合和保护DNA的能力;并进一步测定GC-PEI聚合物的毒性,研究复合物的肝靶向转染效率。结果：在GC-PEI与DNA质量比为1∶1-2.5∶1时,GC-PEI聚合物能有效地结合和保护所携带的DNA免受核酸酶和血清的降解。复合物粒子呈规则的球形,有明显的核壳结构。GC-PEI聚合物在检测细胞中未显示出明显毒性;动物体内急性毒性实验显示：通过尾静脉注射50-300μg的GC-PEI聚合物入小鼠后,实验小鼠2周内无急性毒性反应和死亡发生。荧光显微镜和流式细胞仪检测证实GC-PEI/DNA复合物在肝细胞系（QSG7701/core,L02）中的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）表达明显高于非肝细胞系（SGC-7901,HBE）细胞。体内实验表明转染48 h后,小鼠肝组织在荧光显微镜下可以检测到明显的绿色荧光,而其他主要脏器未见明显荧光。结论：GC-PEI聚合物能够在体内外特异性将外源基因或DNA导入肝细胞,具有良好的肝靶向性。

靶向性半乳糖化聚乙二醇-聚乙烯亚胺纳米载体介导siRNA质粒对肝癌细胞BEL-7402的转染效率检测

目的检测靶向性半乳糖化聚乙二醇-聚乙烯亚胺(Gal-PEG-PEI)纳米载体介导siRNA质粒(psiRNA)对肝癌细胞BEL-7402的转染效率。方法纳米粒径仪测定Gal-PEG-PEI/psiRNA纳米粒的粒径和zeta电位;以Gal-PEG-PEI/psiRNA为研究组,以聚乙二醇-聚乙烯亚胺(PEG-PEI)/psiRNA、Lipofectamine2000和裸psiRNA转染为对照组,转染BEL-7402细胞,48h后用流式细胞仪测定各组的转染效率。转染前加入1mg半乳糖观察各组的半乳糖竞争拮抗结果。结果 Gal-PEG-PEI/psiRNA复合物的粒径随氨基与磷酸基比例(N/P)的增大而减小,最小粒径为81.1nm;Gal-PEG-PEI载体的转染效率为(24.34±2.55)%,与Lipofectamine2000组的转染效率(22.88±1.22)%比较差别无统计学意义(P>0.05),但明显高于PEG-PEI的转染效率(12.91±0.36)%及裸psiRNA的转染效率(0.73±0.08)%,差别有统计学意义(P<0.01);加入竞争拮抗剂半乳糖后Gal-PEG-PEI介导的转染效率由(24.34±2.55)%下降至(5.85±1.83)%,差别有统计学意义(P<0.01)。结论 Gal-PEG-PEI/psiRNA纳米粒对肝癌细胞BEL-7402有较高的转染效率,具有良好的肝细胞靶向性。

聚乙烯亚胺负载基因和蛋白质共递送实验

通过构建载体/基因/蛋白共递送复合体系,探讨了阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI,25 kDa)负载基因和蛋白在细胞中共递送的效率。实验采用凝胶阻滞电泳确定了聚乙烯亚胺与蛋白、基因形成稳定复合物的最佳质量比为2∶1∶0.05。激光扫描共聚焦成像结果表明,聚乙烯亚胺可以有效递送Cy5-pDNA和FITC-BSA进入细胞。通过β-半乳糖苷酶(β-Gal)原位染色法、Western blot和Caspase-3活性检测实验,进一步分析了递送蛋白β-Gal的活性和p53基因的转录翻译功能。结果显示,PEI介导递送的β-Gal保持了较高的酶活性,可以有效催化底物的分解。共负载p53基因转染细胞后,p53蛋白表达水平显著上调且可以激活p53蛋白相关信号通路中关键性激酶Caspase-3。