半乳糖基转移酶gttA基因缺失对4b型单增李斯特菌致病性的影响

【目的】探究半乳糖基转移酶gttA基因缺失对单增李斯特菌表面蛋白锚定及致病性的影响,以期为单增李斯特菌致病机制研究提供参考。【方法】通过同源重组方法构建gttA基因缺失株,分析亲本株ScottA、缺失株ΔgttA、回补株CΔgttA的生长与运动能力;通过Western blotting探究gttA基因缺失对单增李斯特菌2种表面毒力蛋白InlB、ActA锚定的影响。采用结肠腺癌细胞系(Caco-2)进行黏附与侵袭试验及小鼠感染试验评估gttA基因缺失后对单增李斯特菌黏附与侵袭能力和致病性的影响。【结果】单增李斯特菌正常生长与运动能力不受gttA基因缺失的影响。Western blotting结果显示,gttA基因缺失导致毒力蛋白InlB和ActA在细菌细胞壁表面的锚定量极显著降低(P<0.01)。细胞黏附与侵袭试验结果显示,ΔgttA对Caco-2细胞的黏附和侵袭能力极显著低于ScottA和CΔgttA(P<0.01)。小鼠感染试验结果显示,gttA基因缺失导致单增李斯特菌在小鼠肝脏及脾脏中的定植能力极显著或显著减弱(P<0.01;P<0.05)。将gttA基因回补后,细菌对Caco-2细胞的黏附与侵袭水平,以及在肝脏、脾脏中的定植能力均能恢复至亲本株ScottA水平。【结论】gttA基因缺失并不影响单增李斯特菌生长与运动能力,但会影响主要毒力蛋白在单增李斯特菌表面的锚定,减弱该菌对Caco-2细胞系的黏附与侵袭能力及对小鼠的致病性。

微小RNA-148a-3p靶向核心1β13-半乳糖基转移酶1增强肺腺癌细胞的放疗敏感性的研究

目的探讨微小RNA-148a-3p(miR-148a-3p)在肺腺癌中的表达及临床意义,分析miR-148a-3p靶向蛋白核心1β13-半乳糖基转移酶1(C1GALT1)对肺腺癌细胞放疗敏感性的影响及机制。方法选取肺腺癌组织芯片中76例患者肿瘤组织及肺腺癌A549细胞株为研究对象。对组织芯片分别进行miR-148a-3p原位杂交(ISH)染色和C1GALT1免疫组织化学染色,分析76例肺腺癌患者肿瘤组织中miR-148a-3p的表达与临床病理、预后及C1GALT1表达的关系。采用细胞转染技术对A549细胞进行miR-148a-3p过表达质粒的转染;转染细胞接受2 Gy放疗后采用克隆形成实验检测细胞的放疗敏感性;采用蛋白质印迹法检测细胞C1GALT1蛋白表达水平;采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-148a-3p与C1GALT1的靶向调控关系;采用共转染技术分析miR-148a-3p调控A549细胞放疗敏感性的机制。结果76例肺腺癌组织中低表达miR-148a-3p与患者淋巴结转移显著相关(P=0.012);miR-148a-3p高表达者预后显著优于miR-148a-3p低表达者(P=0.005);肺腺癌组织中miR-148a-3p与C1GALT1的表达呈显著负相关(P=0.023)。多因素分析显示,miR-148a-3p低表达、T分期及淋巴结转移是预后的独立危险因素。克隆形成实验显示,过表达miR-148a-3p组克隆形成数显著低于对照组(P<0.001);Western Blot结果显示,miR-148a-3p过表达可以显著下调细胞中C1GALT1蛋白水平(P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验显示miR-148a-3p通过结合C1GALT1的3′UTR来调控C1GALT1的表达。功能拯救试验显示C1GALT1能够部分抵消miR-148a-3p的放疗增敏效应。结论肺腺癌中miR-148a-3p低表达与淋巴结转移、C1GALT1高表达及预后不良显著相关,miR-148a-3p通过负调控C1GALT1的表达增强肺腺癌细胞的放疗敏感性。

UDP-糖基转移酶GmSGT2催化金盏花苷E的半乳糖基修饰

通过qPCR从大豆cDNA文库克隆得到UDP-糖基转移酶GmSGT2的基因,构建工程菌株E.coli BL21/pET28a-GmSGT2,通过His-tag标签法得到纯化的GmSGT2,探究GmSGT2底物特异性,考察pH、温度对GmSGT2的影响,测定其催化金盏花苷E的动力学常数,通过分子对接阐明GmSGT2的底物识别机制。结果表明:GmSGT2可将1分子半乳糖转移到金盏花苷E糖上的C2位置,实现糖上加糖。除UDP-半乳糖外,GmSGT2还可识别UDP-葡萄糖、UDP-木糖和UDP-阿拉伯糖,相对酶活为24.67%~37.60%。GmSGT2催化金盏花苷E的最适温度为40℃,最适pH为7.5,催化效率k_(cat)/K_m为2.71 L/(mmol·s)。分子对接结果表明,His20是GmSGT2的催化氨基酸,Ser19、Ala146、Arg260、Tyr262、Ser291、Leu353、Trp370、Asn371、Thr372和Glu391参与识别底物。GmSGT2催化金盏花苷E半乳糖苷化的研究为酶法合成半乳糖苷衍生物提供指导意义。

β-1,3半乳糖基转移酶-1和β-1,3半乳糖基转移酶-2在乳腺癌中的表达及临床意义

目的检测β-1,3半乳糖基转移酶-1(β-1,3-galactosyltransferase-1,B3GALT1)和β-1,3半乳糖基转移酶-2(β-1,3-galactosyltransferase-1,B3GALT2)在乳腺癌组织及癌旁正常组织中的表达及其与临床病理特征之间的关系,并分析其相关通路。方法选取乳腺癌及癌旁组织标本132例,采用Western Blot法和免疫组化方法检测B3GALT1和B3GALT2在乳腺癌及癌旁正常组织中的表达,分析其临床意义。通过基因集富集分析法探索相关通路。结果乳腺癌组织中B3GALT1和B3GALT2表达均低于癌旁正常组织(P<0.05),二者表达呈正相关(r=0.635,P<0.001),且两者表达阳性患者与阴性患者的T分期和Ki-67比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。B3GALT1和B3GALT2均富集于JAK-STAT通路和Notch通路。结论B3GALT1和B3GALT2在乳腺癌中低表达,与乳腺癌的增殖、生长密切相关。

β-1,3-半乳糖基转移酶2对脑缺血损伤模型小鼠脑损伤的作用及其机制

目的探讨β-1,3-半乳糖基转移酶2(B3galt2)对脑缺血损伤模型小鼠脑损伤的作用及其机制。方法将成年雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(Sham组)、大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型组、MCAO模型+慢病毒载体对照组(LV-GFP组)、MCAO模型+慢病毒载体过表达B3galt2组(LV-B3galt2组),每组6只。各组小鼠于脑缺血24 h后进行神经功能缺损评分和旋转棒实验,采用2,3,5-三氨基苯甲四氮唑染色测定脑梗死体积,采用尼氏染色法观察各组小鼠脑缺血半影区神经元数量,检测各组小鼠脑组织中氧化应激相关因子水平。结果与Sham组比较,MCAO模型组小鼠脑梗死体积增大,神经功能缺损明显(P<0.05),脑缺血区神经元数量明显减少,活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平明显升高(均P<0.05),超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)水平明显降低(均P<0.05);与MCAO模型组比较,LV-B3galt2组小鼠脑梗死体积减小,神经功能明显改善(P<0.05),脑缺血区神经元数量明显增加,ROS和MDA水平明显降低(均P<0.05),SOD和GSH水平明显升高(均P<0.05)。结论B3galt2过表达可以减轻脑缺血损伤模型小鼠脑损伤,其作用机制可能是通过抑制氧化应激反应实现的。

蛋白质O连接N-乙酰半乳糖胺糖基化与心血管疾病

蛋白质O连接N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)糖基化是在多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶(GalNAc-T)的催化下将糖供者尿苷二磷酸GalNAc(UDP-GalNAc)的GalNAc连接到蛋白质的丝氨酸或苏氨酸上,以α异构键形成Tn抗原,是O连接GalNAc糖基化蛋白质生物合成中的第一步^([1])。从目前研究可以发现,作为生物体内最重要的翻译后修饰之一,O连接GalNAc糖基化不仅参与正常细胞的代谢活动,还与恶性肿瘤、心血管疾病等在内的多种重大疾病的发生和发展密切相关,有望在临床上获得广泛的应用^([2])。我们围绕近年来O连接GalNAc糖基化在心血管疾病中的作用和机制进行总结,旨在为心血管疾病的临床治疗和预防提供依据。

空肠弯曲菌β1,3-半乳糖基转移酶(CgtB)突变体的设计及活性鉴定

来自空肠弯曲菌的β1,3-半乳糖基转移酶(CgtB)主要负责蛋白质O-连接糖基化的第二步延伸,在O-连接N-乙酰半乳糖胺(O-GalNAc)修饰后面添加一个半乳糖,目前CgtB已经被广泛应用于体外O-连接糖基化的合成。为了开发O-GalNAc修饰的识别工具,CgtB蛋白质用于突变体设计。在基因水平删除N端30个氨基酸及C端的30个氨基酸得到Cgt1,将Cgt1构建在pMal-c5x表达质粒上并通过大肠杆菌进行原核表达。可溶性的Cgt1经过麦芽糖结合蛋白(MBP)亲和层析柱进行纯化并利用糖结合实验进行活性分析。结果显示,大肠杆菌体系可以成功表达可溶性重组Cgt1蛋白质,相对分子质量约为70000,重组的Cgt1具备结合O-GalNAc修饰蛋白质的活性;针对不同的标准糖蛋白,Cgt1只识别含有O-GalNAc修饰的黏蛋白(mucin);对于复杂的细胞样品,Cgt1可以特异性识别细胞内的O-GalNAc修饰。该研究开发的识别O-GalNAc修饰工具,为进一步研究O-GalNAc修饰的功能奠定了基础。

α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶等位基因467C>T和539G>C变异导致A_2亚型

为了研究中国汉族人群ABO血型系统中A2亚型的分子遗传背景,发现并鉴定新的ABO等位基因,采用血型血清学方法鉴定5例ABO血型疑难样本,PCR扩增ABO基因转录调控序列和全编码序列,PCR产物经割胶纯化后直接测序,并对含有变异位点的扩增片段进行单倍体序列分析。结果表明5例疑难样本分别鉴定为A2或A2B亚型;进一步研究发现,1例A2B和1例A2样本分别含有A201和A205等位基因,另3例A2B样本中发现一个新的A2等位基因。该等位基因与A101相比,差异在外显子7的467C>T和539G>C变异,导致多肽链P156L和R180P的替换。结论首次发现467C>T和539G>C组合的A2等位基因,中国汉族人群中A2亚型具有遗传多态性。

茶树类黄酮3-ο-半乳糖基转移酶基因克隆及功能研究

糖基转移酶(UGT)是专门催化化合物糖基化反应的酶,能够有效提高类黄酮苷元化学稳定性并增加其水溶解度。为探究茶树中类黄酮糖基转移酶基因的功能,本研究以红叶2号紫芽茶品系紫色芽叶为材料,通过RACE技术,克隆了1个UGT基因。结果表明,UGT基因cDNA全长1 701 bp,包含一条大小为1 362 bp的CDS,编码454个氨基酸。该基因编码的蛋白与多个物种的类黄酮3-ο-半乳糖基转移酶(F3GalT)蛋白高度同源,且在其序列C端发现一段PSPG box特征序列,因此被命名为CsF3GalT。RT-qPCR结果表明,CsF3GalT基因在紫芽品种的表达水平均极显著高于绿芽品种,在同一紫芽品种紫叶中的表达水平也显著高于绿叶。对CsF3GalT基因构建原核表达载体,体外酶活试验表明CsF3GalT能够催化UDP-半乳糖与杨梅酮形成杨梅酮-3-ο-半乳糖,而不能催化UDP-葡萄糖和杨梅酮反应。CsF3GalT表达产物定位于细胞质、细胞膜和细胞核中。本研究为进一步阐明茶树UGTs的功能及其在花青素合成途径中的作用奠定了一定的理论基础。

Schwann细胞表达β1,4半乳糖基转移酶-Ⅰ对神经元轴突生长的影响

为了探讨周围神经Schwann细胞中不同β1,4半乳糖基转移酶-1(β-1,4-GalT-I)表达水平对神经元轴突生长的影响,本实验首先构建了正、反义β-1,4-GalT-I表达质粒,然后将构建的不同浓度的正、反义表达质粒超表达于分离、纯化的大鼠Schwann细胞,最后将转染的Schwann细胞与分离的大鼠背根神经节共培养;根据共培养神经元轴突延伸的数目和面积,分析Schwann细胞中不同β-1,4-GalT-I表达水平对神经元轴突生长的影响。结果发现:转染正义β-1,4-GalT-I的Schwann细胞能促进共培养神经节神经元轴突的长出和延伸。在一定的转染浓度内,这种促神经生长作用随转染浓度增大而增强,而转染反义β-1,4-GalT-I却有相反的作用。提示周围神经Schwann细胞中表达β-1,4-GalT-I可能在维持正常神经的功能和促进损伤神经的修复发挥重要作用。

α1,3-D-半乳糖基转移酶基因425C→T突变导致B3亚型分析

目的:探讨B3亚型及其家系成员的血型血清学特点及分子机制。方法:对B3亚型及其家系成员进行ABO血型血清学定型,血浆α1,3-D-半乳糖基转移酶活性测定,ABO基因第6、7外显子及其侧翼序列的PCR扩增,基因测序和克隆分析。结果:先证者血型血清学鉴定ABO血型为B3亚型,血浆中α1,3-D-半乳糖基转移酶活性<1,该家系中2份标本ABO基因序列与标准序列相比,在第7外显子存在c.425C→T的杂合突变,致α1,3-D-半乳糖基转移酶的第142位氨基酸由甲硫氨酸替换为苏氨酸,先证者ABO基因型为B305/O102,且能在家系中稳定遗传。结论:基因位点突变425C→T是导致B3亚型的分子遗传基础,DNA测序能够阐述ABO血型亚型的分子机制及其稳定遗传特性。

敲除α-1,3-半乳糖基转移酶基因五指山小型猪的繁育和鉴定

目的总结α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)基因敲除(GTKO)五指山小型猪的繁育和鉴定。方法统计GTKO五指山小型猪的繁育结果及窝产仔数;采用聚合酶链反应(PCR)技术对GTKO五指山小型猪GGTA1基因敲除类型进行鉴定;采用荧光显微镜和流式细胞术对人、野生型五指山小型猪、GTKO五指山小型猪外周血单核细胞(PBMC)的α-1,3-半乳糖(αGal)表型进行检测;比较GTKO五指山小型猪与野生型五指山小型猪血常规指标的差异。结果 GGTA1基因型的遗传符合孟德尔定律;GGTA1-/-猪的PBMC流式检测无荧光表达,与基因型鉴定结果一致;GTKO五指山小型猪雌性猪初产窝产仔数为(6.8±1.8)只,经产窝产仔数为(8.3±2.2)只;血常规检测的各项指标与野生型五指山小型猪差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论连续2代GTKO五指山小型猪遗传稳定,繁殖力正常。GTKO五指山小型猪可作为异种器官移植研究的可靠供体。

β1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ对施万细胞增殖的影响

目的 探讨周围神经施万细胞表达 β1,4 半乳糖基转移酶 Ⅰ (β 1,4 GalT Ⅰ )对其增殖的影响。 方法 将构建的正、反义 β 1,4 GalT Ⅰ表达质粒 ,转染到施万细胞中 ,分析转染细胞倍增时间、3H TdR掺入情况以及细胞周期变化。 结果 转染正义β 1,4 GalT Ⅰ后施万细胞的增殖受到抑制 ,这种作用随转染浓度增大而增强 ;在G1 /G0 期的细胞数目增加 ,S期的数目减少。而转染反义 β 1,4 GalT Ⅰ有相反的作用。 结论 β 1,4 GalT Ⅰ对施万细胞的增殖有抑制作用 ,可能在周围神经施万细胞的增殖调节中发挥重要作用。

ERK在TNF-α诱导内皮细胞β-1,4-半乳糖基转移酶-I表达中的作用

目的研究细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导内皮细胞β-1,4-半乳糖基转移酶-I(β-1,4-GalT-I)表达的调节作用。方法用不同浓度的TNF-α刺激人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),并作用不同的时间,检测β-1,4-GalT-I表达变化;应用ERK通路抑制剂U0126预处理HUVECs,再用TNF-α刺激HUVECs,检测β-1,4-GalT-I的表达变化,并通过内皮-单核细胞黏附试验观察HU-VECs黏附能力的改变。结果 TNF-α诱导HUVECsβ-1,4-GalT-I表达增加,且具有剂量和时间依赖关系;U0126显著抑制TNF-α引起的HUVECsβ-1,4-GalT-I表达的上调及其黏附能力的上调。结论 ERK信号转导通路可能参与调节TNF-α诱导的内皮细胞β-1,4-GalT-I的表达,并影响内皮细胞的黏附能力。

猪、牛成纤维细胞α-1，3-半乳糖基转移酶基因的敲除以及人白细胞抗原-G1基因的敲入

构建了敲除猪α-1,3-GT并敲入人白细胞抗原HLA-G1基因的打靶载体pZJ,其中以新霉素抗性基因（Neo）为正筛选基因,绿色荧光蛋白基因（GFP）为负筛选基因。采用优化的脂质体转染法将打靶载体pZJ转染于一个长势良好的胎猪成纤维细胞系中,经7天G418（600μg/ml）药物筛选,共获得30个Neo抗性细胞克隆,其中12个为非绿色荧光细胞克隆,7个扩大培养良好,提取阳性克隆细胞的基因组DNA并进行PCR检测。经PCR结果检测,打靶载体转入到胎猪成纤维细胞中,其中3个非荧光阳性单克隆细胞在细胞基因组中进行了定点整合。以同样的脂质体转染条件将pZJ转染牛胎儿成纤维细胞,经筛选并对其进行PCR检测,其中2个均为定点整合阳性。该研究为今后克隆出表达HLA-G1而不表达α-1,3-GT基因的个体猪,从而提供可以真正用于临床的异种器官打下了基础,也为猪牛之间的跨物种敲除提供了一个佐证。

N-糖链合成相关β-1,4-半乳糖基转移酶在大鼠坐骨神经损伤后的表达变化

为了分析与 N-糖链合成相关β-1,4-半乳糖基转移酶 - 、 、 (β-1,4-galactosyltransferase , , ,β-1,4-Gal T- , , ) m RNA在正常和损伤坐骨神经组织的表达变化。本研究采用 RT-PCR方法 ,分析 β-1,4-Gal T- 、 、 在小鼠坐骨神经中的表达存在。以扩增的 c DNA片断标记探针 ,Northern blot分析β-1,4-Gal T- 、 、 m RNA在正常和损伤大鼠坐骨神经的表达变化。结果表明 :通过 RT-PCR方法 ,检测到 β-1,4-Gal T- 、 、 在小鼠坐骨神经中的表达存在 ;采用 Northern blot方法 ,发现β-1,4-Gal T- 、 、 在正常大鼠坐骨神经中有表达 ,并在坐骨神经损伤后发生表达变化 ,但三种同功酶的表达变化各不相同。结论 :本实验发现 β-1,4-Gal T- 、 、 在坐骨神经有表达 ,并在坐骨神经损伤后发生表达变化。提示与

小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因转染胃癌GC9811细胞的功能研究

通过RT PCR从BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞扩增出编码小鼠α1,3 半乳糖基转移酶基因的全长cDNA并构建其真核表达载体pCDNA3 1/V5 HisAα1,3GT ,pCDNA3 1/V5 HisAα1,3GT通过脂质体转染胃癌GC9811细胞 ,使胃癌细胞表达Galα(1,3)Gal糖表位 ,G4 18筛选 2个月内的阳性克隆 ,RT PCR鉴定转染细胞 ,间接免疫荧光染色检测转染真核表达载体的癌细胞Galα(1,3)Gal的表达 ,利用人体血清内针对Galα(1,3)Gal糖表位的天然抗体对癌细胞进行杀伤。结果表明 ,成功构建了α1,3 半乳糖基转移酶基因真核表达载体 ,转染α1,3 半乳糖基转移酶基因的癌细胞高表达Galα(1,3)Gal糖表位 。

敲除猪α1,3-半乳糖基转移酶基因并敲入HLA-G1基因的打靶载体构建

本实验室已克隆到猪α1,3半乳糖基转移酶基因(α1,3GT,第九外显子不全)。其中pMD3arm载体上有5.0kb的片段,该片段包括了小部分第8外显子,完整的第8内含子和一部分第9外显子。本实验中利用LAPCR的方法,从猪的基因组中获得约2.0kb的猪α1,3GT的第9外显子序列的扩增产物,将片段克隆于pGEMTeasy载体。将5.0kb和2.0kb片段分别作为打靶载体的5′,3′同源臂,以neo为正选择标记基因,以GFP为负选择标记基因,构建敲除猪α1,3半乳糖基转移酶基因并同时能表达人白细胞抗原HLAG1基因的的打靶载体pZJ。经酶切图谱和测序结果的鉴定成功地构建出敲除猪α1,3半乳糖基转移酶基因并同时能表达人白细胞抗原HLAG1基因的正负双向选择的打靶载体,为异种器官移植提供了很好的探索。

miR-27a-3p抑制β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅲ表达对胃癌SGC-7901细胞的影响

目的目前关于胃癌中miRNAs靶向调控β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅲ(B4GALT3)表达的具体机制尚不明确。文中旨在分析miR-27a-3p对胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移及侵袭的影响,探讨其分子机制。方法生物信息学预测B4GALT3基因的靶miRNAs,针对B4GALT3′UTR与靶miRNA结合位点构建荧光素酶报告基因载体,检测其相对荧光素酶的活性;将miR-27a-3p mimic、mimic NC、control(空白对照)、miR-27a-3p inhibitor、inhibitor NC分别瞬转入SGC-7901细胞后,Western blot检测各转染细胞B4GALT3的表达情况;采用MTT、迁移、侵袭实验检测细胞的增殖、迁移、侵袭能力。结果与正常胃黏膜GES-1细胞比较,B4GALT3在胃癌各个细胞系中表达显著上调(P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-27b-3p能使野生型B4GALT3的荧光素酶的活性显著性降低(P<0.001),说明miR-27a-3p与B4GALT3存在靶向关系。Western blot检测结果显示,瞬转miR-27a-3p mimic后,B4GALT3蛋白水平下降(P<0.05);瞬转miR-27a-3p inhibitor后,B4GALT3表达升高(P<0.01),说明miR-27a-3p对B4GALT3有负性调控作用。24、48、72、96、120 h,与mimic NC、空白对照比较,miR-27a-3p mimic的细胞增殖显著升高(P<0.05);与inhibitor NC、空白对照比较,miR-27a-3p inhibitor的细胞增殖显著降低(P<0.05)。miR-27a-3p mimic的迁移细胞数量[(319.3±13.9)个]较mimic NC[(218.0±10.7)个]明显增加(P<0.000);侵袭细胞数量[(402.0±15.0)个]较mimic NC[(241.0±17.3)个]明显增加(P<0.000)。miR-27a-3p inhibitor迁移细胞数量[(115.6±13.8)个]较inhibitor NC[(214.6±6.8)个]明显减少,迁移能力明显降低(P<0.000)。结论miR-27a-3p通过抑制B4GALT3表达,促进胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移和侵袭能力,为寻找胃癌治疗靶点提供了实验依据。

地高辛标记的小鼠β-1,4-半乳糖基转移酶RNA探针的制备和应用

为了制备小鼠 β-1,4-半乳糖基转移酶 ( β-1,4-galactosyltransferase ,β-1,4-Gal T- )地高辛标记的 RNA探针以探讨β-1,4-Gal T- m RNA在坐骨神经组织的表达定位 ,本研究用提取的小鼠脑总 RNA,采用 RT-PCR方法 ,得到β-1,4-Gal T- 的 DNA片断 ,将其克隆到 p GEM-T载体 ;采用体外转录的方法合成地高辛标记的正、反义β-1,4-Gal T- RNA探针 ;运用点杂交的方法分析标记探针的灵敏度 ;最后应用该探针 ,通过原位杂交的方法 ,分析 β-1,4-Gal T- m RNA在小鼠坐骨神经的表达。结果 :构建了β-1,4-Gal T- /p GEM-T质粒 ,获得了高效价的地高辛标记的正、反义β-1,4-Gal T- RNA探针 ,应用该探针发现 β-1,4-Gal T- 在小鼠坐骨神经髓鞘中有表达。以上结果表明 ,制备的地高辛标记的正、反义 β-1,4-Gal T- RNA原位杂交探针可特异地检测β-1,4-Gal T- m RNA在组织中的表达。本研究为进一步分析β-1,4-Gal T- 在坐骨神经及其它神经组织发育和损伤过程中的表达奠定基础。