β-半乳糖苷酶基因(lacZ)在海藻裙带菜中的稳定表达

借鉴海带遗传转化模式 ,利用基因枪法将 β 半乳糖苷酶基因 (lacZ)导入裙带菜雄配子体中 ,一部分诱导形成营养增殖的丝状体 ,另一部分和雌配子体受精生成孢子体。五个月后组织化学染色结果表明 5 %的孢子体个体和 30 %的丝状体细胞表现了lacZ的稳定表达 ,利用PCR和PCR Southern检测得到了预期的阳性信号。本文结果提示了利用基因枪转化方法 。

半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及IPTG诱导条件

从嗜热脂肪芽孢杆菌 (IAM 110 0 1)中克隆出编码热稳定的半乳糖苷酶蛋白基因bgaB ,构建具T7强启动子的pET 2 0 (b) bgaB质粒 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达 .经IPTG诱导后 ,重组菌周质中乳糖酶酶活达到 0 .12U /mL ,胞内酶活为 1.35U /mL ,比酶活为 6 .6 6U/mg蛋白 ,比酶源菌产生的酶活提高 5 0倍 .通过对IPTG诱导时机、诱导浓度和诱导时间的优化研究 ,重组菌产生的比酶活进一步提高至酶源菌的 90倍 .

β-半乳糖苷酶基因(lacZ)在大型经济海藻裙带菜中的瞬间表达

用高压氦气式基因枪将SV4 0启动子驱动下的 β 半乳糖苷酶基因 (lacZ)导入大型经济海藻裙带菜不同部位的组织切块中 ,4 8小时后染色检测 ,在假根、孢子叶和叶片中均检测到了lacZ的瞬间表达。研究还发现 ,对于裙带菜组织块的基因枪法转化 ,压强130 0psi优于 110 0psi。另外在裙带菜中没有发现半乳糖苷酶的染色本底。本文结果提示 :基因枪法是有效的裙带菜遗传转化方法 ;lacZ可以作为裙带菜基因工程研究的报告基因 ,SV4 0启动子能有效驱动外源基因在裙带菜中表达 ,没有组织特异性。这是lacZ在裙带菜中表达的首次报道 。

德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的非融合表达

目的在大肠杆菌中非融合表达德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶,为构建能高效表达β-半乳糖苷酶的食品级益生菌株奠定基础。方法选择德氏乳杆菌保加利亚亚种(1.1480和wch9901)β-半乳糖苷酶基因(lacZ)起始密码ATG上游-18bp到ATG下游1bp的一段包含SD位点和ATGA位点的序列为上游引物,PCR扩增lacZ,插入表达质粒pMG36e构建重组表达质粒。转化大肠杆菌,筛选阳性克隆,提取重组质粒进行酶切鉴定和测序,并测定转化菌β-半乳糖苷酶活性。结果重组质粒酶切鉴定合格;其中插入的外源片段序列与德氏乳杆菌保加利亚亚种lacZ标准序列符合率达99%以上;携带重组质粒pMG36e-lacZ1.1480的大肠杆菌DH5α酶活性为3.074U/mL,酶比活性为6.939U/mgpro;携带重组质粒pMG36e-lacZwch9901的大肠杆菌DH5α酶活性为4.755U/mL,酶比活性为8.537U/mgpro。结论成功在大肠杆菌中非融合表达了德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶;本研究选择的SD位点和ATGA位点能在大肠杆菌中有效地引导蛋白的非融合表达。

草莓β-半乳糖苷酶基因FaTβgal的克隆与表达分析

利用SSH和RACE技术,从‘丰香’草莓果实中分离了1个草莓β-半乳糖苷酶（β-Gal）基因,命名为FaTβgal。FaTβgal基因cDNA序列全长2 891bp,ORF区2 448bp,编码815个氨基酸,含有保守序列GGPIILSQIENEY和凝集素结构域。FaTβgal推导氨基酸序列与已报道的3个草莓β-Gal基因Faβgal1（CAC44500）、Faβgal2（CAC44501）、Faβgal3（CAC44502）氨基酸序列有47.1%～48.1%的相似性。与其它物种24个β-Gal基因聚类分析表明,FaTβgal聚在一个独立的分枝上。采用实时荧光定量PCR技术,对FaTβgal基因在果实发育成熟过程中的表达分析表明,该基因在果实中特异表达,随着果实成熟表达量升高,粉红期达到峰值,全红期迅速下降;2个软硬不同的品种表达模式趋于一致。研究认为,FaTβgal基因是β-Gal基因家族的一个新基因,该基因可能在果实成熟软化过程中发挥作用。

耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

【目的】研究耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达,并检测其酶学性质,为耐热β-半乳糖苷酶的应用和工业化生产奠定基础。【方法】利用基因工程的原理和方法,将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶基因(bgaB)克隆到大肠杆菌pET表达系统(pET-28a(+)),并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。将构建的重组菌(pET28a-bgaB)在含硫酸卡那霉素的液体LB培养基中以IPTG为诱导剂,对表达产物的最适反应温度、最适反应时间I、PTG诱导浓度、热稳定性及酶促动力学进行检测。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bgaB,并测得耐热β-半乳糖苷酶的最适反应温度为65℃,最适反应时间为6 h,IPTG的最佳诱导浓度为1 mmol/L,且具有良好的热稳定性;在诱导后6 h,耐热β-半乳糖苷酶的表达量占菌体总可溶性蛋白的20%,表达效率较高;对透析蛋白进行蛋白质定量,蛋白质量浓度为0.75 mg/mL,透析蛋白的耐热β-半乳糖苷酶活性为75 U/mL,比活性为100 U/mg;酶促动力学研究表明,耐热β-半乳糖苷酶的反应常数为0.398μmol/mL,最大反应速度为27.435μmol/(min.mL)。【结论】耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中得到成功表达,并且在很大程度上提高了耐热β-半乳糖苷酶的活性。

耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达

将来自嗜热脂肪芽孢杆菌IAM 110 0 1的高温乳糖酶基因bgaB亚克隆到具强启动子的大肠杆菌载体 pKK 2 2 3 3中 ,经IPTG诱导后 ,表达出的重组蛋白质仍具有耐高温活性 ,其相对分子质量与天然蛋白质相似 ,表达量为 1.5U/mg ,比出发菌株高

阳离子脂质体Lipofectin介导的β-半乳糖苷酶基因在_及GRC细胞株中的表达

目的 :研究阳离子脂质体Lipofectin介导的 β 半乳糖苷酶基因在不同肿瘤细胞株中的表达。 方法 :质粒pDCβ在大肠杆菌DH5α中扩增后用碱裂解法提取 ,并经Sepharose 2B凝胶过滤柱层析 ,以Lipofectin分别转染人肝癌细胞株HepG2 、人肾癌细胞株GRC ,然后用X gal细胞化学染色法检测 β 半乳糖苷酶活性。 结果 :β 半乳糖苷酶活性在HepG2 、GRC中均有表达。结论

四环素基因表达调控系统调控β-半乳糖苷酶基因在肝癌细胞中的表达

目的:构建调控β-半乳糖苷酶(β-gal)基因表达的四环素基因表达调控载体,验证其在肝癌细胞内调控β-半乳糖苷酶基因的表达,为进一步利用该调控系统调控治疗基因治疗肝癌奠定实验基础。方法:根据2个四环素调控子结合位点(TetO2)基因与pcDNA3.1载体的基因核苷酸序列,设计引物,以pcDNA3.1载体为模板进行PCR。将具有串联2个四环素调控子结合位点(TetO2)基因的PCR产物连接入pcDNA3.1载体CMV启动子下游,构建成pcDNA3.1-TetO2载体,应用ABI3130测序仪利用pcDNA3.1-TetO2载体对TetO2PCR产物进行测序分析。再将β-gal克隆入pcDNA3.1-TetO2载体,构建成受四环素调控表达的β-半乳糖苷酶基因的表达载体pcDNA3.1-TetO2-β-gal。利用脂质体将携带四环素调控子基因(TR)的pcDNA6/TR载体转染到肝癌细胞HepG2中,利用杀稻瘟菌素进行细胞转染的稳定筛选,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TR基因在HepG2细胞内的表达。将pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体转染到稳定表达pcDNA6/TR的HepG2细胞中,转染3～4d后,给予强力霉素(4mg.L-1),利用β半乳糖苷酶原位染色试剂盒染色,检测β-半乳糖苷酶基因的表达。结果:构建的pcDNA3.1-TetO2载体测序结果表明,串联2个四环素调控子结合位点(TetO2)基因片段插入到pcDNA3.1载体CMV启动子基因下游。pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体酶切鉴定结果表明,β-gal成功地克隆入pcDNA3.1-TetO2载体。RT-PCR结果显示,TR基因在pcDNA6/TR转染的经杀稻瘟菌素筛选的HepG2细胞内得到稳定表达。给予强力霉素后,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR基因的HepG2细胞内得以表达;而未给予强力霉素,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR基因的HepG2细胞内表达受到抑制。结论:成功地构建了调控β-半乳糖苷酶基因表达的四环素基因表达调控载体,利用该载体成功地调控了β-半乳糖苷酶基因在HepG2细胞内的表达。

β-半乳糖苷酶基因在猕猴桃果实成熟过程的表达

从成熟中华猕猴桃果实中克隆到了一个 β 半乳糖苷酶基因cDNA片段 ,其长度为 747bp ,有一由 2 49个氨基酸组成的开放阅读框架 ,它与苹果、芦笋、绿花椰菜、番茄中 β 半乳糖苷酶基因cDNA相应区段的核苷酸同源性为 6 7.3 %～ 70 .3 %,氨基酸同源性为6 9.1%～ 72 .7%。用该片段为探针进行Northern分析表明 ,果实采收时 ,β 半乳糖苷酶mRNA水平最高 ,随后呈下降变化 ,同时 β 半乳糖苷酶基因的表达可为外源乙烯所诱导 ,但在果实乙烯跃变期间 β 半乳糖苷酶基因的表达信号无显著变化。文中对 β

酿酒酵母α-半乳糖苷酶基因重组菌株的表达分析

PCR扩增里氏木霉(Trichoderma reesei)2个α-半乳糖苷酶基因agl2和agl3,将其分别与表达载体pY-ES2连接,电转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVSc1菌株。从重组菌株提取载体进行单酶切凝胶电泳检测,证实agl2和agl3分别在重组菌株AGL2和AGL3表达。以葡萄糖和棉子糖为碳源培养菌株,2株重组菌的生长速率均显著高于原始菌株,提前8h菌数达到最大,其中以AGL3的生长速率提高较为明显,重组还使菌株在液体培养基由原来的部分絮凝转变为完全游离状。2株重组菌株均不能利用蜜二糖为碳源生长。

大鼠肾囊内β-半乳糖苷酶基因注入及其在肾脏内的局部表达

目的基因治疗的研究受到学术界广泛关注,治疗性基因定向导入体内、定位性表达、继而发挥局部特异性治疗是基因治疗学的研究热点。本研究以β-半乳糖苷酶基因为实验基因,对基因治疗的定向性、定位性、特异性进行了深入研究。研究基因定向导入定位表达的可行性,探讨一种基因定向导入局部表达治疗肾脏病的新技术。方法选用正常雄性SD大鼠15只,应用β-半乳糖苷酶基因,以脂质体为载体进行肾周脂肪囊内注射,分别在注射后12、24、36、48、72h及7天观察肾脏内的基因表达,及肾外脏器:心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肌肉的表达情况。结果肾囊内注射β-半乳糖苷酶基因后12h可见肾脏内有半乳糖苷酶表达,表达持续存在,直至7天;全身其它脏器未见表达。基因表达仅限于肾小管内,肾小球内未见表达。结论基因定向导入肾囊内后可在肾脏组织内表达。本方法简便易行,为肾脏病的基因治疗开拓了一条新途径。

分枝犁头霉WL511热稳定α-半乳糖苷酶基因克隆及序列分析

构建并筛选耐热分枝犁头霉cDNA文库获得639 bp热稳定α-半乳糖苷酶基因片段,并以5′-RACE和3-′RACE技术获得上下游片段1817 bp和1092 bp,拼接得α-半乳糖苷酶全长序列2228 bp,其完整开放读码框为2142 bp,编码713个氨基酸,G+C含量43%;产物预测等电点5.2,预测相对分子质量81000。该基因(GenBank No.DQ234280)属α-半乳糖苷酶36家族,与其他来源的α-半乳糖苷酶基因同源性较低,与链霉菌Streptomyces avermitilis MA-4680的α-半乳糖苷酶同源性最高为38%。

人肠道来源大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因突变株的构建

目的:使用嗜热二型内含子基因失活系统(Thermotargetron)失活人肠道来源大肠杆菌(HSM174 DE3)β-半乳糖苷酶基因(LacZ),构建lacZ失活突变株。方法:使用分子克隆方法,构建lacZ基因失活质粒pHK-TT1A-lacZ426a、pHK-TT1A-lacZ1879a、pHK-TT1A-lacZ1880a及pHK-TT1A-lacZ1155s,将基因失活质粒转化大肠杆菌HSM174菌株(E.coli HSM174),转化子培养时提高温度至48℃,诱导TeI3c/4c二型内含子“归巢”活性,采用蓝白斑及PCR筛选lacZ基因失活突变株。结果:随机挑选20株克隆菌株的PCR结果显示,lacZ426a、lacZ1879a、lacZ1880a及lacZ1155s基因失活效率分别为60%、75%、60%及75%;白斑克隆基因失活效率为100%。结论:Thermotargetron系统可高效的实现E.coli HSM 174菌株lacZ基因失活,并可能具有在中温菌中广泛应用的潜力。

大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因缺陷型菌株的筛选

本研究以大肠杆菌 (含有 β-半乳糖苷酶基因 )为试验对象 ,用氮 -甲基 -氮 -硝基 -氮 -亚硝基胍对其进行诱导突变 ,在选择培养基上对突变体菌株进行筛选。结果成功地对鸡消化道共生乳酸菌进行了诱导突变 ,筛选到了β-半乳糖苷酶基因缺陷型的大肠杆菌受体菌株 ,从而为构建以 β-半乳糖苷酶基因为选择标记的载体表达系统奠定了基础。

保加利亚乳杆菌β-半乳糖苷酶基因的扩增及其影响因素

目的 通过扩增得到保加利亚乳杆菌编码高效β-半乳糖苷酶的基因 ,并探讨影响扩增的因素。方法采用溶菌酶加冻融法提取细菌 DNA;选取不同的模板浓度、退火温度分别进行扩增。结果 模板浓度 6 0 ng/μl、退火温度 6 6℃是保加利亚乳杆菌β-半乳糖苷酶基因的较优扩增条件。结论 优化了扩增保加利亚乳杆菌β-半乳糖苷酶所需的退火温度、模板浓度等条件 。

基于α-半乳糖苷酶基因为筛选标记的酿酒酵母诱导型表达载体的构建及应用

以α-半乳糖苷酶基因为筛选标记,构建GAL1诱导型启动子介导的酿酒酵母表达载体YGM-α-gal质粒,将枯草芽孢杆菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆到此载体中,构建质粒YGMPA-α-gal,转化宿主酵母后,实现β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酿酒酵母中的分泌表达.结果表明:在2%半乳糖诱导下,摇瓶发酵24h后分泌表达的β-葡聚糖酶活性达到411.9U爛mL-1,而在培养60h后,发酵液中α-半乳糖苷酶活性可达64.2U爛mL-1.说明α-半乳糖苷酶基因可用作酿酒酵母表达载体转化的有效筛选标记,为食品级酿酒酵母表达系统的构建提供了新选择.

鸡消化道β-半乳糖苷酶基因缺陷型共生乳酸菌的筛选

以健康雏鸡消化道优势共生乳酸菌为试验对象 ,用氮_甲基_氮_硝基_氮_亚硝基胍对其进行 β_半乳糖苷酶基因缺陷型菌株定向诱导突变 ,在选择培养基上对突变体菌株进行筛选。结果成功地对鸡消化道共生乳酸菌进行了诱导突变 ,筛选到 β_半乳糖苷酶基因缺陷型的乳酸菌受体菌株 ,为构建以 β_半乳糖苷酶基因为选择标记的食品级载体表达系统奠定了基础。