半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶荧光定量测定及保存条件对酶活性的影响

目的探讨荧光定量测定导致经典型半乳糖血症的半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GALT)的方法,以及不同保存条件对酶活性的影响。方法选取来本院就诊的半乳糖血症患儿及其父母为研究对象,随机选取健康体检儿童作为对照,采集肝素抗凝血,用定量荧光法测定GALT活性,并观察不同保存温度和不同时间的GALT活性的变化。结果本方法表明酶反应1hr时可以分辨出完全失活型和杂合子,诊断出75%的半乳糖血症患儿,并检测出4例杂合子。同时发现随着时间的推移GALT活性在下降,室温影响最大。结论本方法简单,准确,快捷,费用低廉适合于半乳糖血症的诊断和杂合子的检出,但要注意高温和保存时间对样品的影响。本法也适合于新生儿大规模筛查和孕妇杂合子的检出。

半乳糖血症患儿半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因突变的鉴定与分析

目的从分子水平研究半乳糖血症患儿半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因（GALT基因）突变情况。方法选取2例确诊为半乳糖血症的患儿，分离其外周血淋巴细胞，提取总RNA，RT—PCR扩增GALT基因全长cDNA；将PCR产物亚克隆至T—easy载体，筛选阳性克隆并测序；同时，采用限制性片段多态性的方法将PCR产物进行酶切鉴定。结果2例患儿均出现了未报道过的突变。其中1例患儿GALT基因1006位A突变为G，导致M336V氨基酸突变；另1例患儿GALT基因779位A突变为T，导致H260L突变。这2例突变均为碱基替换形成的错义突变，且均为杂合型突变。结论基因诊断可提高半乳糖血症诊断的准确性，并为该病的产前筛查、造血干细胞移植甚至基因治疗提供有价值的参考。

内皮素-1对肺组织磷酸胆碱二胞苷酰转移酶的影响

目的 在离体肺组织培养模型上观察低浓度 (1×10 -13 ～ 1× 10 -9mol·L-1)内皮素 1(ET 1)对肺表面活性物质 (PS)脂质主要成分磷脂酰胆碱 (PC)合成的限速酶———CTP :磷酸胆碱二胞苷酰转移酶 (CCT)活性的影响。方法 采用无血清成年大鼠肺组织培养 ,以 [M 14 C]胆碱作为前体参入CDP 胆碱 ,液闪测定14 C放射性强度 ,反映CCT活性。结果 ①CDP [M 14 C]胆碱的产量随微粒体和胞浆蛋白量增加、反应时间延长 (0～ 30min)而增多 ;②ET 1(1× 10 -12～ 1× 10 -9mol·L-1)以剂量依赖性提高微粒体CCT活性 ;③ET 1(1× 10 -10 mol·L-1)作用 8h ,微粒体CCT活性开始增强 ,随作用时间延长 (8～ 16h) ,酶活性逐渐增强 ;④ET 1(1× 10 -10 mol·L-1)可提高细胞微粒体CCT活性 ,而降低胞质CCT活性 ;⑤H 7和W 7均可分别抑制ET 1(1× 10 -10mol·L-1)促微粒体CCT活性增强的效应。结论 ET 1可促进肺组织细胞胞质CCT向微粒体转位 ,增加微粒体CCT活性 。

基于尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1解毒通路探讨枸杞汁对邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯代谢的干预作用

目的:通过大鼠毒性干预实验观察枸杞汁对邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)染毒大鼠肝脏中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1(uridine diphosphate glucuronosyltransferase 1,UGT1)活性及代谢解毒的影响,探讨枸杞汁对DEHP代谢的干预效果。方法:60只雄性大鼠随机分为对照组、DEHP组和枸杞汁干预组,每组20只,DEHP组和干预组在DEHP一次染毒(3 000 mg/kg mb)后连续7 d分别灌胃生理盐水和枸杞汁,对照组则给予同等体积的芝麻油或生理盐水,期间每天收集大鼠24 h尿液。在染毒1、3、5、7 d后各组分别随机处死5只。采用试剂盒检测肝脏UGT1的活力,高效液相色谱法检测血清中的邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(mono-(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP)以及尿液MEHP和邻苯二甲酸(phthalic acid,PA)含量。结果:枸杞汁干预组大鼠第5天UGT1活性显著高于DEHP组和对照组(P<0.05),且相对于DEHP组血清中MEHP含量减少而尿液中MEHP和PA含量增加。结论:枸杞汁可能通过提高UGT1活力促进了DEHP的代谢与排泄,发挥了解毒效应,将来可能作为一种预防或对抗邻苯二甲酸酯类物质或其他有毒化学物潜在危害的保健药材或功能食品用于人群的健康防护。

微RNA-342-3p/末端尿苷酰转移酶1/凝血酶敏感素-2通路在胰腺导管腺癌中的作用及机制

目的探讨微RNA(miR)-342-3p/末端尿苷酰转移酶1(TUT1)/凝血酶敏感素-2(THBS2)通路在胰腺导管腺癌中的作用及miR-342-3p、TUT1、THBS2 mRNA表达与患者临床病理学参数的关系。方法选择2008年5月至2021年3月在遂宁市中心医院行根治性手术切除的胰腺导管腺癌标本(n=80)和对应癌旁正常组织标本(n=20)为研究对象。采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测胰腺导管腺癌组织和癌旁正常组织中miR-342-3p、TUT1、THBS2 mRNA的表达。将对数生长期人胰腺导管腺癌细胞株PANC-1细胞分为对照组(转染miR-NC)、miR-342-3p过表达组(转染miR-342-3p mimic)、miR-342-3p抑制剂组(转染miR-342-3p inhibitor)、Vector组(转染pCS4-HA vectors)、TUT1组(转染pcDNA3-Flag-TUT1)、阴性对照组(转染sh-NC慢病毒载体)、TUT1沉默组(转染pGCshL-TUT1载体)、miR-342-3p过表达+TUT1组(同时转染miR-342-3p mimic和TUT1)、miR-342-3p过表达+THBS2组(同时转染miR-342-3p mimic和THBS2)、TUT1+THBS2组(同时转染pcDNA3-Flag-TUT1和THBS2)。采用细胞计数试剂盒-8检测10组细胞的增殖能力,采用流式细胞术检测10组细胞的凋亡情况,采用双荧光素酶报告系统检测miR-342-3p与TUT1的靶向关系,采用Western blot法检测对照组、miR-342-3p过表达组和miR-342-3p抑制剂组PANC-1细胞中TUT1、THBS2蛋白的表达。结果胰腺导管腺癌组织中miR-342-3p TUT1、THBS2 mRNA的相对表达量显著低于癌旁正常组织(P<0.05)。不同年龄、不同肿瘤大小、淋巴结是否转移和不同肿瘤分期患者癌组织中miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA的表达比较差异均无统计学意义(P>0.05);高分化癌组织中miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA的表达显著高于中+低分化癌组织(P<0.05)。培养0 h时,各组PANC-1细胞的增殖能力比较差异均无统计学意义(P>0.05)。培养24、48、72 h时,TUT1组细胞的增殖能力均显著低于Vecort组,细胞的凋亡率显著高于Vecort组(P<0.05)。培养24、48、72 h时,TUT1沉默组细胞的增殖能力显著高于阴性对照组,细胞凋亡率显著低于阴性对照组(P<0.05)。培养24、48、72 h时,miR-342-3p抑制剂组的细胞增殖能力显著高于对照组(P<0.05),miR-342-3p过表达组的细胞增殖能力显著低于对照组(P<0.05)。培养24 h时,miR-342-3p过表达+TUT1组、miR-342-3p过表达+THBS2组、TUT1+THBS2组与miR-342-3p过表达组的细胞增殖能力比较差异均无统计学意义(P>0.05)。培养48、72 h时,miR-342-3p过表达+TUT1组、miR-342-3p过表达+THBS2组、TUT1+THBS2组的细胞增殖能力均显著低于miR-342-3p过表达组(P<0.05)。miR-342-3p抑制剂组细胞的凋亡率显著低于对照组(P<0.05),miR-342-3p过表达组细胞的凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。miR-342-3p过表达+TUT1组、miR-342-3p过表达+THBS2组、TUT1+THBS2组细胞的凋亡率显著高于miR-342-3p过表达组(P<0.05)。miR-342-3p过表达组细胞中野生型TUT1报告基因的荧光素酶活性显著高于对照组(P<0.05),突变型TUT1报告基因的荧光素酶活性与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-342-3p过表达组细胞中TUT1和THBS2蛋白的相对表达量显著高于对照组(P<0.05),miR-342-3p抑制剂组细胞中TUT1和THBS2蛋白的相对表达量显著低于对照组(P<0.05)。结论激活miR-342-3p/TUT1/THBS2通路可抑制PANC-1细胞增殖,促进其凋亡,进而抑制胰腺导管腺癌的发展,miR-342-3p/TUT1/THBS2通路有望成为诊治胰腺癌的潜在靶点。

人多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶2基因反义RNA表达质粒的构建及其功能的初步研究

反义封闭人多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(pp-GalNAc-T2)的基因表达,对胃癌细胞SGC7901中转化生长因子-β1(TGF-β1)与基质金属蛋白酶2(MMP2)基因表达及细胞增殖有影响.在对几株肿瘤细胞的pp-GalNAc-T2基因表达水平进行分析后,以高表达pp-GalNAc-T2的人胃癌细胞株SGC7901的总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增两段不同长度pp-GalNAc-T2基因片段,构建反义表达载体转染胃癌细胞SGC7901,通过G418筛选,建立一系列旨在封闭胃癌细胞SGC7901ppGalNAc-T2基因表达的亚细胞克隆.通过流式细胞术、荧光显微镜、RT-PCR及Western印迹检测反义封闭pp-GalNAc-T2基因RNA表达后胃癌细胞SGC7901增殖以及TGF-β1、MMP2表达水平的变化.反义封闭pp-GalNAc-T2基因表达后,胃癌细胞SGC7901 pp-GalNAc-T2的表达水平明显降低,细胞分裂增殖减慢,表明反义封闭pp-GalNAc-T2基因表达对胃癌细胞SGC7901的生长增殖有影响.结果还显示,反义封闭pp-GalNAc-T2基因表达可使TGF-β1、MMP2基因在mRNA与蛋白质表达水平均增加,提示pp-GalNAc-T2基因表达可能对胃癌细胞SGC7901浸润转移产生影响.以上结果表明,pp-GalNAc-T2基因在肿瘤细胞中广泛表达,并可能与肿瘤的增殖及浸润转移相关.

金线莲甘露糖-1-磷酸尿苷转移酶基因的克隆与表达分析

【目的】甘露糖是金线莲多糖重要组成成分,对甘露糖-1-磷酸尿苷转移酶(GMP)基因进行克隆和基因表达调控分析,为进一步研究金线莲多糖的生物合成奠定基础。【方法】以梅花山金线莲植株为材料,克隆ArGMP基因的cDNA序列和基因组序列,利用在线软件进行生物信息学分析,并对其基因表达调控模式进行qRTPCR分析。【结果】金线莲ArGMP基因ORF区序列长1086 bp,共编码361个氨基酸;基因组序列长度为1760 bp,含有3个内含子,GenBank登录号OQ030271。生物信息学分析表明:ArGMP蛋白是一种较稳定的、无跨膜结构的亲水蛋白,该蛋白与铁皮石斛、深圳拟兰、蝴蝶兰等兰科植物的亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示:ArGMP基因在金线莲不同组织中的表达量差异显著,在花中的表达量最高;在不同种植温度处理条件下,25℃时表达量最高,高温严重抑制其表达;35℃高温处理不同时间显示,处理3 h后ArGMP基因表达量显著下降;而不同浓度NaCl胁迫处理对ArGMP基因表达基本无影响。【结论】克隆了甘露糖-1-磷酸尿苷转移酶基因的cDNA序列和基因组序列,发现该基因具有组织特异性表达的特点,且该基因受温度调控,而不受盐胁迫调控,这为进一步研究金线莲多糖生物合成调控机制奠定理论基础。

尿苷二磷酸-葡萄糖4-差向异构酶编码基因galE影响甘薯青枯菌致病性和碳代谢

为明确尿苷二磷酸(uridine diphosphate,UDP)-葡萄糖4-差向异构酶编码基因galE的功能,通过构建甘薯青枯菌galE基因敲除菌株ΔgalE及回补菌株CΔgalE,探索galE基因与甘薯青枯菌致病相关表型间的关联及对甘薯青枯菌生理代谢的影响。结果表明:galE基因缺失显著降低了青枯菌对甘薯的致病性,并且影响了致病相关表型。ΔgalE菌落流动性、菌体泳动能力、胞外多糖含量和生物膜形成量均明显低于野生型SPRS911和CΔgalE。在半乳糖代谢途径中,galE基因缺失后,参与尿苷二磷酸葡糖与葡萄糖之间代谢的galU、pgm、glk基因表达量降低,D-葡萄糖-6-磷酸累积;与UDP-半乳糖代谢有关的dgoK、dgoAa、dgoAb、malZ和galM基因表达量升高。galE基因缺失还加强了甘薯青枯菌对于苹果酸的同化作用。上述研究结果说明,galE基因对青枯菌的致病性与碳代谢水平均有明显影响。

高血氨对大鼠血清胆红素及肝组织血红素加氧酶1、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1表达的影响

目的:分析高血氨状态下大鼠胆红素水平、胆红素代谢相关的血红素加氧酶1(HO-1)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)表达的变化及NF-κB通路的激活情况。方法:25只成年健康雄性Wistar大鼠分为2组:高血氨组15只,每天给予氯化铵灌胃2次;对照组10只,同法灌胃生理盐水。每周心脏采血一次,应用ELISA检测血清总胆红素(TBIL)与直接胆红素(DBIL)水平。4周后处死大鼠,心脏灌流后取肝脏,免疫组化SP染色观察HO-1与NF-κB的表达,RT-PCR检测UGT1A1mRNA的表达水平。结果:高血氨组大鼠血清TBIL、DBIL均较对照组明显升高(TBIL:F组间=201.524,F时间=446.552,P均<0.001;DBIL:F组间=131.864,F时间=455.413,P均<0.001)。高血氨组HO-1蛋白表达量(2250.31±620.43)较对照组的(156.66±10.28)上调(t=56.829,P<0.001),高血氨组NF-κB阳性细胞百分比为(0.248±0.052)%,较对照组的(0.072±0.033)%增加(t=62.347,P<0.001)。高血氨组UGT1A1mRNA的表达水平(0.611±0.152)高于对照组的(0.328±0.063)(t=6.449,P<0.001)。结论:血氨升高时TBIL和DBIL亦随之升高,HO-1和UGT1A1在组织中的表达增加,提示组织处于氧化应激状态,NF-κB通路被激活。

同型半胱氨酸对THP-1单核细胞源性泡沫细胞形成中ABCA1、ACAT1表达的影响

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对THP-1单核细胞源性泡沫细胞形成中三磷酸腺苷-结合转运子A1(ABCA1)和酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(ACAT1)表达的影响。方法将THP-1单核细胞与佛波酯(PMA)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)共同培养,复制泡沫细胞模型,并分别用50、100、200、500μmol/L Hcy和100μmol/L Hcy+叶酸+维生素B12(Vit B12)干预72 h,并设对照组(不加入Hcy)。采用油红O染色检测泡沫细胞的形成。采用酶终点法测定细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)含量的变化,观察Hcy对泡沫细胞CE流出的影响。采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定ABCA1、ACAT1 mRNA表达;免疫印迹法检测ABCA1、ACAT1蛋白表达。结果油红O染色显示Hcy加剧了泡沫细胞的形成,但不呈量效关系。实验组(加入50、100、200、500μmol/L Hcy和100μmol/L Hcy+叶酸+Vit B12)泡沫细胞阳性百分率均高于对照组(P<0.05、P<0.01),以100μmol/L Hcy组效应最为明显(P<0.01)。在Hcy的干预下,泡沫细胞胞内TC、FC、CE流出减少,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),以100μmol/L Hcy组效应最为明显(P<0.01)。100μmol/L Hcy+叶酸+VitB12组与100μmol/L Hcy组比较,前者泡沫细胞形成减少,胆固醇流出增多。RT-PCR结果显示ABCA1 mRNA表达下调,ACAT1 mRNA表达上调,均以100μmol/L Hcy组效应最为明显(P<0.01);免疫印迹法检测ABCA1、ACAT1蛋白的表达与其mRNA表达一致。结论 Hcy下调了ABCA1的表达,上调了ACAT1的表达,促使了泡沫细胞形成。

尿KIM-1蛋白诊断早期造影剂肾病的实验研究

目的测定大鼠尿液肾损伤分子-1(KIM-1)蛋白含量以研究其在造影剂肾病(RCIN)早期诊断中的价值。方法成年雄性SD大鼠72只随机分为A、B、C组(n=8)和D组(D组又分为2,6,12,24,48 h和7 d小组,n=8),采用尾静脉注射方法,每组注射3种药物,均间隔15 min。A组注射磷酸盐缓冲液(PBS)、生理盐水(NS);B组注射PBS、NS和造影剂(CM);C组注射吲哚美辛(INDO)、一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)和NS;D组注射INDO、L-NAME和CM。结果 D组大鼠给药6 h后血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)含量显著升高(P<0.001),在给药24 h达到高峰,并于48 h基本恢复正常。组织学可见D组用药后6 h出现显著的病理学变化,出现小管间质弥漫性充血、出血,明显的肾小管坏死和肾小管结构消失;给药后12 h仍然存在显著的小管坏死,以及肾小管结构消失,但是小管间质充血出血程度减轻;给药后24 h肾髓质外带小管已经再生;给药后7 d时肾小管结构仍未完全恢复。D组给药后尿液KIM-1值和NAG值在各时间点均有不同程度升高,尿液KIM-1值在给药后2 h开始升高,24 h达高峰,并持续到7 d(P<0.001);尿液NAG值在6 h开始升高,48 h基本恢复正常;尿液MMP-9值在D组给药后各组均未见升高。结论测定大鼠尿KIM-1含量可以作为早期诊断RCIN的指标之一。

联合检测尿液α_1-MG、NAG及尿液Cystatin C对肾损害早期诊断的临床意义

[目的]探讨尿液α1-微球蛋白(α1-MG)、N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(NAG)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin C)联合检测对诊断肾脏早期损害的临床价值.[方法]采用免疫比浊法检测尿液α1-MG、CystatinC的含量,连续监测法检测尿液N乙酰β-D氨基葡萄糖苷酶(NAG).[结果]患者尿中α1-MG、NAG、Cystatin C水平均显著高于对照组(P<0.01).单纯检测上述指标中的一项或两项阳性率较低,联合检测三项阳性率较高.[结论]检测尿液α1-MG、NAG、Cystatin C是早期肾损害的敏感指标,联合检测对患者肾脏损伤的早期诊断和疗效观察有重要的意义.

ABCA1、ACAT1 DNA甲基化在Hcy致THP-1单核源性泡沫细胞胆固醇流出中作用研究

目的探讨ABCA1、ACAT1 DNA甲基化在同型半胱氨酸(Hcy)致THP-1单核源性泡沫细胞胆固醇流出中的作用。方法复制泡沫细胞模型,用50、100、200、500μmol·L-1Hcy和100μmol·L-1Hcy+叶酸+维生素B12(100+F+V)干预,并设对照组(0μmol·L-1Hcy)。油红O染色观察泡沫细胞形成,巢式降落式甲基化特异性PCR(nMS-PCR)检测ABCA1、ACAT1 DNA甲基化水平,并分析两者比值变化;ELISA-like法检测DNA甲基转移酶(DNMTs)活性;化学比色法分析细胞内胆固醇含量。结果成功复制了泡沫细胞模型;给予不同浓度Hcy刺激后,ABCA1 DNA甲基化改变呈上升趋势,ACAT1 DNA甲基化改变呈下降趋势,给予100+F+V干预后可逆转上述变化,其中ABCA1 DNA甲基化改变更明显;同时,不同浓度Hcy可使泡沫细胞内DNMTs活性和胆固醇含量增加。结论 ABCA1和ACAT1 DNA甲基化的改变参与了Hcy致THP-1单核源性泡沫细胞胆固醇流出,DNMTs可能起关键调控作用。

β-1,3-N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因433C＞T突变导致罕见Pk表型

目的 探讨P1Pk血型系统中1例罕见Pk表型的血清学特征和分子机制.方法 应用血清学技术鉴定先证者血型,应用聚合酶链反应测序技术对Pk表型相关的β-1,3-N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因（B3GALANT1）编码区及侧翼内含子区进行序列分析.结果 先证者确认为罕见的Pk表型,血清中含有抗-P抗体,其女儿、丈夫为P2表型.测序结果显示：其丈夫、2个随机样本的B3GALANT1基因序列与对照参考序列（GenBank AB050855）完全一致,而先证者的B3GALANT1基因第433位存在C＞T纯合突变,这导致在第145位氨基酸处提前形成终止密码而表达不成熟蛋白,从而可能降低或抑制1,3-N-乙酰氨基半乳糖转移酶的活性.其女儿B3GALANT1基因第433位为C/T杂合.结论 由B3GALANT1基因433位核苷酸C＞T突变导致的Pk表型在中国人群中尚未见报道.

PCR法构建小鼠α-1,3-GT基因沉默载体研究

在已报道的shRNA序列前加上人类H1启动子,设计一段沉默小鼠α-1,3-GT基因的siRNA序列,针对该序列分段设计引物,完全采用PCR法将其连接起来,然后把该序列克隆到pGEM-T载体中,构建出针对小鼠α-1,3-GT基因的特异性沉默载体,为进一步获得α-1,3-GT基因沉默小鼠,构建异种器官移植用小鼠模型奠定了基础。

肾癌786-O细胞B4GALNT1基因RNA干扰模型构建与鉴定

目的构建靶向抑制β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶1(B4GALNT1)基因表达的shRNA慢病毒载体,稳定转染至人肾癌细胞株786-O中,观察转染后抑制效率及对786-O细胞增殖活性的影响。方法构建特异性靶向抑制B4GALNT1基因表达的shRNA慢病毒载体(shB4GALNT1),通过琼脂糖凝胶电泳和阳性克隆测序鉴定载体的构建;慢病毒包装并稳定转染至肾癌786-O细胞中,通过荧光显微镜观察shRNA转染细胞;实验分为3组:空白对照(NC)组、转染空载体(VC)组和转染shB4GALNT1(KD)组,分别通过Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应来证实转染shB4GALNT1在蛋白与mRNA表达水平的抑制效率;通过Celigo全视野细胞扫描分析抑制B4GALNT1表达对786-O细胞增殖活性的影响。结果琼脂糖凝胶电泳证实阳性克隆为341 bp,阳性克隆测序证实B4GALNT1 shRNA慢病毒表达载体构建成功;绿色荧光蛋白表达证实B4GALNT1 shRNA慢病毒表达载体转染至肾癌786-O细胞中;NC组、VC组和KD组B4GALNT1蛋白的相对表达量分别为1.013±0.057、0.916±0.055、0.340±0.030,KD组与VC组比较差异有统计学意义(P<0.01),B4GALNT1蛋白表达抑制率达63%,NC组与VC组比较差异无统计学意义(P>0.05);NC组、VC组和KD组B4GALNT1 mRNA的相对表达量分别为1.021±0.078、1.002±0.074、0.078±0.027,KD组与VC组比较差异有统计学意义(P<0.01),表达抑制率达92%,NC组与VC组比较差异无统计学意义(P>0.05);转染后第2~5天,抑制B4GALNT1表达可显著降低786-O细胞增殖活性(P<0.01)。结论本实验成功构建RNA干扰靶向抑制B4GALNT1基因的慢病毒表达载体,并稳定转染人肾癌786-O细胞,抑制B4GALNT1表达可显著降低细胞增殖活性。

B4GALNT1表达下调抑制骨肉瘤细胞增殖和转移

目的:骨肉瘤是儿童和青少年最常见的骨恶性肿瘤,具有极强的增殖和转移潜能。伴有远处转移的骨肉瘤患者的生存预后极差,且骨肉瘤患者在治疗过程中易出现病灶切除不彻底、化学治疗耐药等难题,目前尚缺乏有效的根治手段。近年来,越来越多的证据表明β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶1(β-1,4-N-acetylgalactosaminyltransferase 1,B4GALNT1)能够影响多种恶性肿瘤的进展。然而,B4GALNT1在骨肉瘤细胞中的功能却未见报道。本研究拟探讨骨肉瘤组织与正常组织中B4GALNT1的表达以及B4GALNT1对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响,以期为骨肉瘤患者的治疗提供新的理论依据和方向。方法:收集在中南大学湘雅二医院行骨肉瘤瘤段切除的16例患者的肿瘤组织及相对应的正常组织样本,骨肉瘤患者的年龄为8~17(中位数12)岁。利用实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR,real-time RT-PCR)检测B4GALNT1 mRNA在骨肉瘤组织、相对应的正常组织、3种骨肉瘤细胞系(MG63、Saos-2、U2OS)及人成骨细胞(human fetal osteoblastic,hFOB)中的表达情况;通过细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)及克隆形成实验分析敲减B4GALNT1对骨肉瘤细胞Saos-2及U2OS增殖能力的影响;利用Transwell迁移和侵袭实验分析敲减B4GALNT1对骨肉瘤细胞Saos-2及U2OS迁移和侵袭能力的影响;使用蛋白质印迹法分析敲减B4GALNT1对Saos-2及U2OS细胞上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及侵袭相关蛋白质表达的影响。结果:Real-time RT-PCR结果表明:与正常组织及h FOB相比,骨肉瘤组织和3种骨肉瘤细胞系中B4GALNT1 mRNA的表达水平较高(均P<0.01)。CCK-8及克隆形成实验结果表明:与对照组相比,敲减B4GALNT1降低了骨肉瘤细胞的增殖速率(均P<0.05)。Transwell迁移和侵袭实验结果表明:与对照组相比,敲减B4GALNT1减少了骨肉瘤细胞的迁移和侵袭细胞数(均P<0.01)。蛋白质印迹结果表明:与对照组相比,敲减B4GALNT1抑制了N-cadherin、Snail、Vimentin和基质金属蛋白酶9(matrix metallopreteinase 9,MMP9)的表达(均P<0.01)。结论:B4GALNT1在骨肉瘤组织及细胞系中表达上调;敲减B4GALNT1抑制了骨肉瘤的恶性表型;B4GALNT1可能作为一个癌基因在骨肉瘤细胞增殖和转移中发挥重要作用。

α-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因467C〉T和745C〉T突变的研究

目的通过对1个罕见的A3亚型家系进行分子遗传学分析，探讨α-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因突变对于A抗原表达的影响。方法采用血型血清学方法对先证者及家系成员进行ABO血型鉴定，应用PCR产物直接测序和基因克隆法对ABO基因的第6、7外显子进行序列分析以及单倍型分析。结果先证者红细胞包含弱A抗原，同时血清中含有抗-A和抗-B抗体。直接测序结果显示ABO基因第6外显子存在261delG突变，第7外显子存在467C〉T和745C〉T两个杂合位点。基因克隆序列分析得到两个等位基因A307和001。A307基因序列与A101基因比对在第467位碱基为C〉T突变和第745位碱基为C〉T，导致多肽链P156L和R249W替换。结论α-1，3半乳糖基转移酶基因467C〉T和745C〉T突变产生A307基因型，导致A抗原表达减弱。

联合转导人α1,3-半乳糖苷酶和α1,2-岩藻糖转移酶基因清除猪细胞表面异种抗原

猪细胞表面Galα1-3Galβ1-4GluNAc-R结构(称为αGal表位)是引起异种器官移植超急性排斥反应的主要原因,被称为主要异种抗原,由α1,3-半乳糖转移酶生成.α1,3-半乳糖苷酶特异性地水解αGal表位末端半乳糖,可清除这种主要异种抗原;α1,2-岩藻糖转移酶与α1,3-半乳糖转移酶竞争底物的作用也可使Galα1,3-Gal的生成量降低并阻止α1,3-半乳糖苷酶水解的产物重新生成Galα1,3-Gal,也具有清除主要异种抗原的作用.以猪胚胎成纤维细胞为靶细胞,联合转导人α1,3-半乳糖苷酶和α1,2-岩藻糖转移酶基因,获得的转基因细胞异种抗原清除率达84%,转基因细胞染色体数目和形态正常,为进一步获得低αGal抗原的体细胞克隆猪奠定了基础.

a-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因467C〉T和804insG变异导致Ael亚型

目的研究ABO基因的a-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因变异对于A抗原表达的影响。方法通过标准血型血清学方法鉴定3份A亚型样本，应用聚合酶链反应一序列特异性引物扩增ABO基因第6、7外显子PCR产物直接测序及基因克隆测序等方法进行ABO基因分型及单倍型序列分析。结果3份A亚型样本的血清学检测结果均为Ael型，其中2份样本分别含有Ae108和001等位基因，1份样本含有Ae108和004等位基因。Ael08等位基因与A101等位基因相比，差异在第7外显子的467C〉T和804insG变异，导致多肽链P156L替换和269位氨基酸移框突变。结论a-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因467C〉T和804insG变异可能是Ael亚型分子基础之一。