一种半变性琼脂糖凝胶电泳技术的改良

建立一种经济快捷的利用半变性琼脂糖凝胶电泳技术分析酵母朊病毒迁移特性的方法,在蛋白样品制备过程中采用珠磨破碎法代替文献使用的昂贵的藤黄节杆菌酶酶解法破碎酵母细胞,使用TBE代替文献使用的TAE作为电泳缓冲液,并使用电湿转法代替文献使用的毛细虹吸法转印蛋白。对酵母朊病毒[PSI+]的朊蛋白迁移特性分析结果显示,改良法不影响文献法的准确性,但降低了实验成本,缩短了实验时间。

血红蛋白全自动琼脂糖凝胶电泳在β地中海贫血中的应用及评价

目的 评价全自动血红蛋白琼脂糖凝胶电泳在 β地中海贫血中的应用。方法 采用全自动琼脂糖凝胶进行血红蛋白 (Hb)电泳 ,测定 Hb- A2 及 Hb- F含量 ,同时采用 Hb- F碱变性试验对同一标本进行Hb- F含量测定 ,比较二种方法对 Hb- F含量的检测结果。结果 检测临床标本 80 0例 ,发现 Hb- A2 增高者 (含量 >4% ) 1 3 0例 ,阳性率为 1 6 .3 %。测定 Hb- A2 的批内 CV<5 % ,批间 CV<8%。同时伴有 Hb- F增高者 5 0例。对于 Hb- F碱变性试验测得 Hb- F含量异常高者 (含量 >3 .1 % ) ,琼脂糖凝胶电泳可以分辨出Hb- F区带 ,且可进行扫描定量 ,测出的 Hb- F含量与 Hb- F碱变性试验基本一致 ;如 Hb- F碱变性试验测定 Hb- F含量在正常范围者 (1 .0 %～ 3 .0 % ) ,电泳便分辨不出 Hb- F区带 ,与 Hb- A一起组成 Hb- (A+F)区带。结论 全自动血红蛋白琼脂糖凝胶电泳法能够分辨出 Hb- A2 及 Hb- F异常增高者 ,为 β地中海贫血的诊断提供重要数据。

全自动血红蛋白琼脂糖凝胶电泳在β地中海贫血的临床应用

目的 :讨论全自动血红蛋白 (Hb)琼脂糖凝胶电泳在 β地中海贫血中的临床应用。 方法 :采用全自动琼脂糖凝胶进行血红蛋白电泳 ,测定Hb -A2 、、Hb -F含量 ,且同时用碱变性试验对其进行检测 ,比较两种方法的检测结果。结果 :检测抗凝血标本 385例 ,发现Hb -A2 增高者 (含量 >4 % ) 5 0例 ,阳性率 13.9% ,同时伴Hb -F增高者 2 0例。Hb -F碱变性试验测的Hb -F含量增高 (含量 >3.1% )。琼脂糖凝胶电泳可分辨出Hb -F区带 ,定量扫描测出的含量与Hb -F碱变性试验基本一致 ;如Hb -F碱变性试验测定Hb -F含量在正常范围者 (1～ 3% )电泳分辨不出Hb -F区带 ,与Hb -A一起组成Hb - (A +F)区带。结论 :全自动Hb琼脂糖凝胶电泳能够清晰分辨出Hb -A2 和Hb -F增高者 ,为地中海贫血的诊断提供重要的数据。

2000例全自动琼脂糖凝胶电泳检测血红蛋白异常结果分析

目的 分析 2 0 0 0例血红蛋白电泳结果 ,探讨全自动琼脂糖凝胶电泳在地中海贫血中的应用。方法 采用全自动琼脂糖凝胶进行血红蛋白 (Hb)电泳 ,测定异常Hb、HbA2 及Hb -F含量 ,同时采用Hb -F碱变性试验对同一标本进行Hb -F含量测定。结果 检测临床标本 2 0 0 0例 ,发现异常Hb 90例 ,其中HbH2 6例 ,HbBart′s 5 6例 ,HbE2 例 ,其它异常Hb快速带 6例。测定HbA2 含量的批内CV <5 % ,批间CV <8%。发现HbA2 增高者 (含量 >4 .0 % ) 14 0例 ,同时伴有HbF增高者 6 0例。对于HbF碱变性试验测得HbF含量异常高者 (含量 >3.1% ) ,琼脂糖凝胶电泳可以分辨出HbF区带 ,且可进行扫描定量 ,测出的HbF含量与HbF碱变性试验基本一致。结论 全自动琼脂糖凝胶电泳分辨率极高 ,能够分辨出极微量异常Hb ,准确分析出HbA2 及HbF异常增高者 ,为地中海贫血的诊断提供准确可靠的数据。

蛋白质复合体非变性凝胶电泳技术及其应用新进展

非变性凝胶电泳技术是研究蛋白质复合体的强有力工具。重点介绍了蓝绿温和非变性凝胶电泳(BN-PAGE)技术的原理和特点,比较了由BN-PAGE衍生的蓝色温和琼脂糖凝胶电泳、清澈温和非变性凝胶电泳(CN-PAGE)和高分辨清澈温和非变性凝胶电泳(HrCN-PAGE)技术的差异和适用范围,并概括地介绍了这些技术在植物蛋白质复合体研究中应用的新进展。

半抗原-载体蛋白偶联物的三种电泳鉴定方法

【目的】建立一种简单方便的半抗原-载体蛋白偶联物电泳鉴定方法。【方法】选用SDS-PAGE、非变性琼脂糖凝胶电泳、高效毛细管区带电泳3种方法对载体蛋白、偶联剂变性的载体蛋白、半抗原-载体蛋白进行比较鉴定,同时与光谱法结果比较。【结果】对分子量差异较小的载体蛋白和半抗原-载体蛋白偶联物,SDS-PAGE不能有效分辨;但偶联前后载体电荷有变化时,非变性琼脂糖凝胶电泳却能有效分辨游离的载体蛋白和半抗原-载体蛋白偶联物,相对SDS-PAGE表现出更高的分辨灵敏度;毛细管区带电泳能高效分辨载体和半抗原-载体蛋白偶联物,结果直观,但需较贵重的专用仪器。琼脂糖电泳和毛细管电泳法与可见-紫外光谱法鉴定结果一致。【结论】3种电泳方法各有优缺点,非变性凝胶电泳简便、廉价、有效,较适合普通实验室使用。

姜半夏致突变性实验研究

目的 :探讨姜半夏的致突变性。方法 :以 3种剂量 (1 0 g/kg、2 0 g/kg、3 0 g/kg)的姜半夏作为实验组 ;以同体积生理盐水作为阴性对照组 ;以环磷酰胺 (CP)作为阳性对照组。以母鼠胸骨骨髓与胎鼠肝脏血作微核分析 ,以小鼠血淋巴细胞作单细胞凝胶电泳 (SCGE)试验。结果 :与阴性对照组相比 ,1 0 g/kg剂量的姜半夏组母鼠骨髓微核率未见显著升高 ,其余各组各项指标均见显著升高。结论 :姜半夏可能有一定的致突变作用。

全自动血红蛋白电泳与Hb-F碱变性试验在β地中海贫血中的应用及评价

目的 评价全自动血红蛋白琼脂糖凝胶电泳与Hb—F碱变性试验在口地中海贫血中的应用。方法 采用全自动血红蛋白琼脂糖凝胶电泳仪进行血红蛋白（Hb）电泳，测定Hb—A2及Hb-F含量，同时采用Hb—F碱变性试验对同一标本进行Hb—F含量测定．比较两种方法对Hb—F含量的检测结果。结果 检测了30例临床标本，发现Hb—A2增高者（含量〉4％）5侧，阳性率〉16．7％，测定Hb-A2的批内CV〈6％，批间〈9％。同时检测出Hb-F含量增高3例。对于Hb-F碱变性试验测得Hb—F含量增高者（含量〉3．1％），通过全自动琼脂糖凝胶电泳可以分辨出HbF区带，并且能进行定量扫描，测出的Hb—F含量与Hb-F碱变性试验测得Hb—F含量基本一致；如果Hb—F碱变性试验测得Hb-F含量在正常范围内（1.0％～3.0％），电泳就不能分辨出HbF区带。结论 全自动血红蛋白琼脂糖凝胶电泳法能够分辨出Hb—A2及Hb—F异常增高者，为β地中海贫血的诊断提供重要的数据。

全自动蛋白电泳系统在筛查β地中海贫血1913例中的应用

目的讨论全自动蛋白电泳系统在筛查β地中海贫血的临床应用价值。方法用法国SEBIA公司生产的Hydrasys LC电泳仪进行血红蛋白电泳，用其配套的Hyrys扫描系统对HbA、HbA2、HbF区带进行扫描，得出各区带的含量，用碱变性试验对HbF含量检测，比较两种方法对HbF含量的检测结果。结果检测临床抗凝血标本1913例，检出HbA，增高（含量〉4．0％）132例，阳性率6．9％。同时伴有HbF增高者36例，对于HbF碱变性试验增高者（〉3．1％），全自动蛋白电泳可分辨出HbF区带，且可定量扫描，扫描结果与HbF碱变性试验基本一致。nbF碱变性试验测定的HbF含量在正常范围者（1％～3．1％），电泳分辨不出HbF区带，与HbA区带一起组成Hb（A＋F）区带。结论全自动蛋白电泳系统能够清晰分辨出异常增高的HbA2、HbF，且可定量扫描，定量扫描HbF结果与HbF碱变性试验检测结果基本一致，在简便、快捷检查β地中海贫血有良好的效果。

半胱氨酸合成酶与β-氰基丙氨酸合成酶活性检测

植物半胱氨酸合成酶(Cysteine synthase,CSase)和β-氰基丙氨酸合成酶(β-cyanoalanine synthase,β-CAS)分别催化合成半胱氨酸(Cysteine,Cys)和β-氰基丙氨酸(β-Cyanoalanine,β-CA),它们在功能上冗余。本研究以山黧豆、苜蓿和玉米为主要材料,结合电泳对8种常见植物CSase和β-CAS粗酶活性进行了分析。结果表明,检测CSase活性时,8种植物两类粗酶的最适反应时间均为10min,最适pH均为8.0,底物O-乙酰-丝氨酸和Na2S最适浓度分别是10和5 mmol·L-1。检测β-CAS活性时,8种植物两类粗酶的最适反应时间均为30min,最适pH均在9~10范围内,底物Cys最适浓度均为3mmol·L-1,而底物KCN最适浓度前者为80mmol·L-1,后者为3mmol·L-1。8种植物中,CSase活性在种、种内组织间差别不是很大,但β-CAS活性则相反,尤其在茎叶和根中差别较大。

白术水提物对酵母朊病毒[PSI^+]治愈作用的定量研究

目的定量研究白术水提物对酵母朊病毒[PSI+]的治愈作用。方法首先用含白术水提物的培养基培养酵母朊病毒[PSI+]阳性菌株,初步评价白术的治愈作用。然后在细胞水平借助影印培养法和蛋白水平上使用半变性琼脂糖凝胶电泳结合蛋白免疫技术进一步验证白术水提物对酵母朊病毒[PSI+]的治愈作用。结果白术水提物作用酵母朊病毒[PSI+]5d后的治愈率为6%。结论白术水提物对酵母朊病毒[PSI+]有一定的治愈作用。

鉴定水稻品种的微卫星标记筛选

选用58个水稻微卫星标记,对目前应用较广的28份杂交水稻亲本材料进行多态性分析,并比较了其中14个标记应用3.0%琼脂糖凝胶电泳和6.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测结果。研究表明,所应用的标记可将所有供试水稻材料区分开,不同标记的多态性检测能力差异较大;两种检测方法所得结果高度一致,但非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率较高、带型清晰,能更准确反映水稻材料间的差异。对于一般水稻材料而言,选用12个标记可将不同材料区别开的几率大于99.9%,但要区分遗传相似性较高的材料,则可能需挑选高多态性标记和(或)增加检测的标记数。

检测总RNA质量的两种方法比较研究

采用普通琼脂糖凝胶电泳和甲醛变性胶电泳两种方法对小鼠、藏绵羊的新鲜组织及非洲绿猴肾细胞提取的总RNA进行检测,比较两种方法对总RNA质量检测的特点.结果显示:甲醛变性胶对总RNA质量检测结果明显优于普通琼脂糖凝胶,证明对总RNA质量的检测更适合采用甲醛变性胶电泳法.

本地黎、杞黎和侾黎人群中Y染色体DYS287和DYS19的多态分布

目的:对中国海南岛本地黎、杞黎和侾黎人群中Y染色体Alu序列和DYS19的多态分布进行调查。方法:采用PCR法对Y染色体特异性微卫星DYS19和Y染色体DYS287位点进行扩增,经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果:在DYS19位点,本地黎群体发现4种等位基因,杞黎和侾黎群体均为3种。等位基因频率分布在3个支系中均以194bp的频率为最高,分别是0.711、0.855和0.667。统计分析显示:杞黎与侾黎人群在DYS19位点的等位基因频率有极显著性差异(P﹤0.01)。在DYS287位点,3个人群均未发生Alu序列插入。结论:DYS19和DYS287位点可以作为重要、稳定的遗传标记对遗传多样性研究提供可靠的证据。

用三引物法提高PCR的扩增效率及特异性

聚合酶链反应(PCR)现已广泛应用于分子生物学研究的各个领域。对于模板量较低的样品及单拷贝基因,通常通过增加扩增的次数或多次PCR提高扩增的效率,但这样往往出现非特异性反应。本文采用三引物双扩增法大大提高了PCR扩增的效率及特异性。 1 材料与方法 Melanoma细胞由本室保存,能分泌人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)。RT

三种凝胶电泳分析分枝杆菌热休克蛋白65基因酶切片段的灵敏度比较

目的比较2％（w，v）琼脂糖凝胶、2％（w，v）Metaphor琼脂糖凝胶和10％（w／v）非变性聚丙烯酰胺凝胶分析分枝杆菌热休克蛋白65（hsp65）基因酶切片段的灵敏度。方法分枝杆菌8株，分别制成10^6-10^1/ml菌悬液。采用通用引物对分枝杆菌hsp65基因序列进行PcR扩增，限制性内切酶BstEⅡ和HaeⅢ对扩增产物进行消化，分别采用2％琼脂糖凝胶、2％Metaphor琼脂糖凝胶和10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析分枝杆菌酶切片段。结果经方差分析，3种检测方法的灵敏度差异有统计学意义（F=36．379，P〈O．01）。最小显著差异法（LsD）多重比较结果显示，2％琼脂糖凝胶方法的灵敏度显著低于2％Metaphor琼脂糖凝胶（P〈O．01），亦显著低于10％非变性聚丙烯酰胺凝胶方法（P〈O．01），而2％Metaphor琼脂糖凝胶与10％非变性聚丙烯酰胺凝胶方法间差异无统计学意义（P〉O．05）。结论2％Metaphor琼脂糖凝胶和10％非变性聚丙烯酰胺凝胶分析分枝杆菌酶切图谱的灵敏度均高于2％琼脂糖凝胶。

甜菜SSR扩增产物不同检测方法的比较研究

利用16对甜菜SSR引物对12个不同的甜菜品种进行扩增,分别采用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、3%的Metaphor琼脂糖电泳以及3%的普通琼脂糖电泳对SSR扩增产物进行检测,比较不同检测结果的差异性。结果表明:8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶分辨细小条带的差异远高于3%的Metaphor琼脂糖和普通琼脂糖,而Metaphor琼脂糖的分辨率高于普通琼脂糖;但对于条带较少的引物,3种凝胶未显现出差异;对于条带数较多的引物,如果条带比较集中,3种检测方法差异显著,如果条带比较分散,3种凝胶之间的差异较小。由于Metaphor琼脂糖价格偏高、胶软不易操作且分辨率低于聚丙烯酰胺凝胶,因此不建议使用。而8%的聚丙烯酰胺凝胶则适合于指纹图谱的构建以及遗传多样性分析等,普通琼脂糖可以应用在品种纯度的鉴定。

胱抑素C联合尿微量白蛋白检测对糖尿病早期肾损害的临床价值

目的探讨血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CYC)联合尿微量白蛋白检测(UMA)对糖尿病早期肾损害的诊断价值。方法将80例糖尿病患者根据其CYC和肌酐(Cr)尿素(Urea)检测结果分为三组:A组为三指标全正常组23例,B组为仅CYC异常组26例,C组为三指标全异常组31例;检测肾功能同时收集患者晨尿作UMA及非浓缩尿蛋白电泳(SDS-AGE)。结果 A组仅1例出现生理性尿蛋白,22例无尿蛋白带,UMA(11.2±5.12)mg/L;B组2例无尿蛋白带,24例出现不同类型的尿蛋白,UMA(41.6±15.5)mg/L;C组31例全部出现不同类型的尿蛋白,UMA(64.4±24.2)mg/L。结论 CYC及UMA对早期肾损害有较高的敏感性,联合SDS-AGE检测对糖尿病早期肾损害的诊断有较高价值。

变性高效液相色谱技术在家族性高胆固醇血症低密度脂蛋白受体基因点突变检测中的应用

目的以变性高效液相色谱(DHPLC),分析检测家族性高胆固醇血症(FH)一汉族家系成员的低密度脂蛋白受体(LDLR)基因突变,以明确诊断。方法收集临床诊断为家族性高胆固醇血症的汉族一个家系共37名成员,其中30人为一级和二级亲属,7名为亲属配偶作为对照,提取基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)方法扩增LDLR基因包含启动子和全部基因编码区(118外显子)及临近的内含子序列共21个片段,琼脂糖凝胶电泳鉴定产物。采用DHPLC技术检测了LDLR基因,对洗脱曲线异常者进行核苷酸序列分析。结果该家系中发现4处变异,其中1处经核苷酸序列测定明确了突变的性质为第3内含子的剪接突变,并在此家系5名成员中得到证实,而对照组中未检出。结论成功地建立了以DHPLC筛查LDLR基因点突变的方法及技术参数,该方法简便,结果稳定,可作为大样本筛查突变位点的一种便捷可靠手段。

激活态雪旺细胞生长相关蛋白43 mRNA表达的研究

目的分析激活态雪旺细胞较正常雪旺细胞生长相关蛋白43(growthassociatiopnrotein43,GAP43)的基因表达变化。方法选取10只SD大鼠,将大鼠右上肢正中神经在腋部切断,预变性,1周后取1cm长正中神经采用双酶消化法获取雪旺细胞并进行激活得到激活态雪旺细胞;取左上肢正常正中神经经双酶消化法获取正常态雪旺细胞作为对照。自雪旺细胞提取mRNA,应用rt-PCR的方法扩增GAP43基因,取PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳,用低浓度的绿色荧光核酸胶染剂染色,测量荧光强度,计算目标基因和内标基因(GAPDH)PCR产物的荧光强度比值,以配对t检验比较实验组和对照组结果。结果激活态雪旺细胞GAP43PCR产物荧光强度比值较正常雪旺细胞明显增高,差异有统计学意义(P=0.003)。表明激活态雪旺细胞较对照组正常雪旺细胞GAP43mRNA表达明显增多。结论激活态雪旺细胞GAP43的基因表达较正常雪旺细胞增强,这可能是其促进神经再生的重要机制。