半合成-酶连法克隆EFsec基因及其初步表达分析

目的将缺失一段编码序列的真核硒代半胱氨酸-tRNA特异性延伸因子(EFsec-)基因补齐,并克隆到真核表达载体进行初步表达分析。方法采用人工合成法合成所缺失的基因片段,然后利用EFsec-基因序列中靠近5'端存在的天然酶切位点进行酶连,再用PCR方法扩增出拼接产物,并将其克隆到pcDNA3.1(-)载体。采用脂质体转染法转染HEK293T细胞后应用RT-PCR法检测EFsec基因的表达。结果准确快捷地将EFsec-基因补齐了其5'端缺失的基因序列,并成功地构建了其表达质粒pcDNA3.1-EFsec,转染哺乳动物细胞后检测到了EFsec基因的显著表达。结论半合成-酶连法可以高效快捷地补齐并克隆缺失的EFsec-基因,提供了一种拼接基因的有效策略和方法,同时也为EFsec基因的下一步研究奠定了基础。