半夏炮制过程中毒性凝集素蛋白的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)受灵敏度和重复性的影响,对完整蛋白的定量分析存在困难。本研究采用纤维素纳米晶体(CNC)辅助MALDI-TOF MS,结合内标法定量分析半夏炮制过程中半夏凝集素(PTL),通过优化CNC辅助样本制备的时长和比例,以麦胚凝集素(TVL)为内标,直接分析不同炮制程度半夏各炮制品及其浸泡上清液中PTL含量。结果表明,CNC辅助MALDI样本制备有效提升了MALDI-TOF MS定量分析的线性和重复性。随着炮制时间的延长,姜半夏、清半夏和法半夏炮制品的PTL含量逐渐下降,浸泡上清液中PTL含量逐渐上升。其中,由于pH值的改变,法半夏炮制品浸泡上清液中PTL含量呈先上升后下降的趋势。此外,将该方法应用于不同饮片生产企业的多批次半夏炮制品饮片中,均未检出PTL。该方法操作简便,可有效分析半夏炮制过程中PTL含量的变化,为研究半夏炮制过程对PTL的影响提供了参考。

ELISA法测定半夏及其炮制品中半夏凝集素含量

目的:研究双抗夹心酶联免疫ELISA法作为半夏及其炮制品中毒蛋白半夏凝集素蛋白(Pinellia ternata lectin,PTL)检查方法的可行性。方法:采用双抗夹心ELISA法,测定半夏不同炮制品中PTL含量。结果:方法学考察结果显示,非线性四参数曲线拟合相关系数r^(2)=0.9999,表明当PTL浓度在0.075~4.80 ng•mL^(-1)浓度范围内,以非线性四参数拟合曲线计算PTL含量的准确度高,且方法精密度、稳定性、重复性较好。26批半夏生品及75批半夏炮制品(清半夏、法半夏、姜半夏各25批)中半夏中PTL含量均值为30.9 mg•g^(-1),其炮制品清半夏、法半夏、姜半夏中PTL含量均值分别为0.92 mg•g^(-1),48.80μg•g^(-1),130.32 ng•g^(-1),表明炮制后PTL含量显著下降,姜半夏中PTL含量最低,其次为法半夏,清半夏含量最高。同时建立半夏不同饮片中内源性毒性蛋白凝集素蛋白限度检查方法,建议清半夏、法半夏、姜半夏中PTL含量分别不超过2.70 mg•g^(-1)、160.0μg•g^(-1)、510.0 ng•g^(-1)。结论:ELISA法测定半夏凝集素蛋白准确可靠,且成本低,可快速批量测定,可以作为半夏及其炮制品中PTL检查方法。

半夏凝集素基因(pta)导入水稻及其表达的初步研究

半夏凝集素基因是一种有重要价值的抗虫基因。利用RACE PCR技术克隆出半夏凝集素 (pta)基因 ,并将它构建到载体pCAMBIA1 30 5中形成双元载体 (含pta基因和hpt基因 )。利用农杆菌介导法将pta基因转入粳稻品种鄂宜 1 0 5、中花 1 2和籼稻品种E优 5 32成熟胚诱导的愈伤组织中。通过PCR检测 ,从 1 1 7株T0 代再生植株中筛选出 36株 (其中鄂宜 1 0 5、中花 1 2、E优 5 32分别为 1 9株、7株、1 0株 )转基因植株。对这些转基因后代植株进行Southernblot分析和RT PCR分析表明 :pta基因已经整合到受体细胞基因组中 ,并在转录水平上得到了有效表达。通过对转基因后代的遗传分析 ,成功地从T1 代表现为 1∶2∶1孟德尔分离的分离群体中筛选出 7个独立转基因水稻纯系 (其中包括 4个鄂宜 1 0 5、1个中花 1 2和 2个E优 5 32转基因纯系 )。对这 7个独立转基因水稻T2 代纯系进行褐飞虱生物抗性鉴定和田间隔离喂养实验 ,结果显示 ,这些转基因纯系对褐飞虱的存活率和发育进度均有显著的抑制作用。同时 ,实验结果还表明 2～ 5mg L的 2 ,4 D是愈伤组织诱导和生长的必需条件 ,而且受体的基因型对愈伤组织诱导率和转化频率均有显著影响 ,在同等条件下 。

四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅱ.转半夏凝集素基因菘蓝的分子生物学检测

目的 获得转基因菘蓝的分子生物学证据。方法 对经卡那霉素筛选的抗性再生菘蓝苗进行聚合酶链式反应 (PCR) ,Southern杂交和 RT-PCR检测。结果 PCR和 Southern杂交检测结果表明 ,外源半夏凝集素基因已经整合到转基因菘蓝的基因组中 ,RT-PCR结果表明其 DNA可以正常转录成 m RNA。结论 可以利用农杆菌介导的基因转化技术培育抗虫的菘蓝新品系。

半夏凝集素基因克隆及其对桃蚜的抗性研究

研究了半夏凝集素(Pinellia ternataagglutinin,PTA)基因对桃蚜(Myzus persicae)的抗性。从半夏幼叶中提取总RNA,采用RT-PCR法分离克隆出PTA1基因cDNA片段,该基因在GenBank中登录号为DQ092435。序列分析表明:该cDNA片段全长为810bp,编码269个氨基酸组成的蛋白,具有单子叶植物甘露糖凝集素基因家族的特征,含有3个由4个氨基酸(QDNY)组成的甘露糖专一结合位点,与报道的天南星科凝集素基因氨基酸序列的同源性在72.7%~92.9%。构建了35S启动子控制下的PTA1基因的植物表达载体pBI121PTA1,该载体含有抗卡那霉素的选择标记基因(nptⅡ),利用根癌农杆菌介导法转化烟草获得抗卡那霉素的植株。PCR和半定量RT-PCR分析表明:PTA1基因已经整合到植物基因组中并在转录水平上得到了有效表达。抗蚜虫鉴定表明:转基因植株有效地抑制了蚜虫的群体增长率,平均抑制率达77.02%,表明该基因对同翅目害虫的抗虫基因工程有重要的应用价值。

半夏凝集素基因的克隆及转基因烟草对蚜虫的抑制作用

采用同源序列克隆方法，通过设计特异性引物从甘肃西和半夏叶片基因组DNA中克隆到1条1069bp的半夏凝集素基因pta，与以同科内植物的mRNA为模板扩增得到的凝集素基因序列的同源性很高，达到98％以上，功能区完整，具有1条信号肽和3个甘露糖结合区，GenBank登录号AY725425。用该基因替换pBI121载体的GUS基因，正向插入35S启动子之下，构建了植物表达载体pBI—pta。通过农杆菌介导法转化烟草，从20株Kan抗性植株中得到PCR检测阳性植株14株，证明pta已整合到烟草基因组中。对随机挑取的7株PCR阳性植株进行了抗蚜虫（Myzus persicae）筛选试验，结果表明：不同株系蚜口密度抑制率在22．5％～89．4％，平均蚜口密度抑制率56．2％。

半夏凝集素在脂双层形成的阳离子通道

半夏凝集素是从多年生植物三叶半夏的块茎鲜汁中分离纯化的糖结合蛋白,具凝集素活性,与甘露聚糖有专一结合。本工作利用双室系统观察了它对人工脂双层的作用。 人工脂双层由卵磷脂和胆固醇(重量比为4:1)的正癸烷溶液形成。电阻≥10GΩ。在电压箝位下将半夏凝集素(1—4μg/ml)加至系统的一小室,几分钟后即观察到通道样活动噪音,脂双层电阻下降。甘露聚糖对这种变化有明显的对抗作用,加入40μg/ml的甘露聚糖可使脂双层的膜电阻立即从2GΩ恢复到对照水平(≥10GΩ)。在低浓度半夏凝集素和低维持电压下可获得单位电导涨落记录。在100mmol/L对称KCl溶液中记录的半夏凝集素单通道电流的优势电导为35pS。通过测定在非对称盐溶液中的平衡电位,根据Goldman—Hodgkin—Katz电位方程可推算出通道的离子选择性。结果表明,半夏凝集素形成的通道为阳离子通道。

半夏凝集素基因对油菜的遗传转化及REAL-TIMEPCR分析

以甘蓝型油菜陇油2号子叶为转化受体材料,通过农杆菌介导将半夏凝集素抗虫基因(pta)导入陇油2号,经常规PCR检测获得阳性植株3株。以油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(pep)作为内参基因、选pta全长序列中高度保守区域中145bp的pta2为目的片段对转基因植株进行REAL-TIMEPCR分析,初步证明外源pta基因已整合到油菜细胞基因组中。

根癌农杆菌介导半夏凝集素基因pBIXPTA对百合的转化

以百合花丝诱导的胚性愈伤组织为基因转化的受体材料,利用根癌农杆菌介导法将pBIXPTA基因导入百合。组织化学法检测转化后共培养3d的组织块,GUS瞬时表达率可达60%,选择培养20d的组织中约有1%检测到GUS基因的稳定表达。菌液浓度OD600值为0.8左右时侵染效果较好,同时于附加100μmol/L的AS可提高转化效率。PCR分子检测转基因植株部分呈现阳性,初步证明外源基因已整合到百合基因组中。

半夏凝集素的分离纯化和在植物中的分布

从半夏(Pinellia ternata)块根中,经95％硫酸铵沉淀和固定化猪甲状腺球蛋白柱亲和层析分离得到一种凝集素,称为半夏凝集素(PTL)。凝胶过滤、SDS-PAGE和免疫双扩散鉴定PTL是均一的样品,分子量约44kD,由四个约12kD的亚基组成。PTL主要存在于半夏的块茎中,茎中也有少量存在。

西和半夏凝集素抗虫基因克隆及对棉花的遗传转化

采用同源序列克隆方法,通过设计特异引物克隆甘肃西和半夏(Pinellia ternata)凝集素基因pta,其序列全长l069bp,编码区804bp,编码268个氨基酸残基,有3个典型的甘露糖结合位点,预测分子量和等电点分别为29.1kD和7.77,GenBank登录号AY725425。构建了35S启动子驱动的植物表达载体pBI-pta。建立了陇棉2号花粉管通道法遗传转化技术,获得5株卡那霉素抗性和PCR检测阳性植株,为建立棉花转基因方法和培育抗虫种质奠定了基础。

半夏凝集素基因对小麦的遗传转化研究

为了拓宽农杆菌介导的小麦遗传转化的受体基因型,同时改良小麦品种的抗蚜特性,以甘肃省主推春小麦品种陇春22和优良品系9614的幼胚为转基因受体材料,以预培养4d的幼胚愈伤组织为受体,以含有半夏凝集素基因的C58c1农杆菌菌株为供体,将重组质粒pBI pta导入小麦,建立了农杆菌介导的小麦遗传转化体系。经G418 25mg.L-1抗性筛选、PCR检测共获得转基因植株7株,其中9614的4株,陇春22的3株;采用荧光定量PCR分析得出转基因植株中单拷贝的有1株,2个拷贝的1株,3个拷贝和4个拷贝的各有2株,1株没有得到扩增。对整合有2个拷贝半夏凝集素基因的陇春22-20转基因小麦的T1代植株进行了PCR检测,其中有50%的植株扩增出目的基因,50%没有扩增出目的基因,初步说明T1代植株中外源基因得到了遗传。

掌叶半夏凝集素基因表达载体的构建与鉴定

从掌叶半夏(Pinellia pedatisecta Schott)块茎中提取总RNA,反转录合成cDNA。根据GenBank中已报道的天南星科凝集素基因序列,设计带有酶切位点的表达引物,用RT-PCR方法扩增出掌叶半夏凝集素(Pinellia pedatisecta agglutinin,PPA)基因。PPA经双酶切后与表达载体pGEX-6P-3连接,构建pGEX-PPA重组表达载体。通过PCR、双酶切及测序鉴定,结果表明,重组载体pGEX-PPA构建成功,为进一步进行PPA的原核表达及其功能研究奠定了基础。

转半夏凝集素基因抗蚜棉花材料对棉蚜的控制效果

采用田间小区系统调查和室内生物测定相结合的方法,研究了转半夏凝集素基因抗蚜棉花材料对棉蚜的控制效果。田间鉴定结果表明,在苗蚜发生高峰期,6个转基因抗蚜材料对棉蚜的抗性不同,蚜指减退率也有较大的差异;其中09-2和09-4的抗性较好,接近抗性2级水平。室内生物测定结果表明,和亲本对照相比,除09-2和09-4材料的棉蚜单雌产仔量略增加外,其它材料均减少,其中09-1、09-4、09-8的棉蚜产仔量差异达极显著水平。生命表参数表明,和对照材料相比,不同材料的净增值率、平均世代周期、内禀增长率、周限增长率和种群加倍时间均有不同程度的变化。总体来说,09-2和09-4材料对棉蚜有较好的控制效果。

掌叶半夏凝集素的分离纯化及抗蚜活性研究

前已发现某些国产药用植物粗提物在体外实验中的杀虫活性与所含蛋白有关。利用45％饱和硫酸铵沉淀,PHE Sepharose FF(26/26)疏水柱层析和Q Sepharose FF(26/13)离子交换柱层析,从掌叶半夏块茎中分离纯化到一种蛋白质(PPA)。PPA在刺吸口器害虫棉蚜或桃蚜的人工饲料中分别含0.12％或0.15％时即显示出明显的致死作用。PPA是一种热稳定性较强,亚基分子量12ku的非共价结合的四聚体凝集素。

半夏凝集素的分离纯化及其对HeLa细胞生长的影响

利用甘露糖-Sepharose 4B亲和柱从半夏总蛋白中分离纯化得到一种12kD的半夏凝集素,经质谱分析明确其为半夏凝集素单体。将该12kD凝集素单体作用于体外培养的HeLa细胞,MTT法检测细胞活性并用倒置相差显微镜观察凝集素对HeLa细胞生长状态的影响。结果显示:低浓度(0.004、0.02、0.1mg/mL)半夏凝集素具有一定促进HeLa细胞增殖的作用;高浓度(0.5、1mg/mL)半夏凝集素有一定抑制Hela细胞增殖的作用。

盾叶半夏凝集素基因的克隆及功能分析

为克隆盾叶半夏凝集素基因,并对其功能进行分析。采用RACE技术从盾叶半夏中克隆得到盾叶半夏凝集素基因的全长cDNA序列,命名为ppl。同时,构建了ppl基因的原核表达载体,并成功实现了33 k Da重组蛋白在E.coli BL21中的表达。纯化后的重组蛋白PPL用于凝血和体外抗癌试验。该基因的全长cDNA序列为1 504 bp,其中开放性阅读框(ORF)813 bp,编码270个氨基酸,具有3个甘露糖结合识别位点。PPL具有凝血活性,这种凝血活性可受甘露糖抑制。PPL对人鼻咽癌细胞(CNE)、人宫颈癌细胞(Hela)及人乳腺癌细胞(Bcap-37)的生长均具有抑制作用,其中对Hela细胞的抑制效果最好。为进一步研究PPL蛋白的功能奠定了理论基础。

半夏凝集素结构预测分析

为进一步深入了解半夏凝集素(Pinellia ternata agglutinin)已知蛋白序列的性质,采用生物信息学预测方法,对其结构进行了系统性分析。从NCBI数据库中调取半夏凝集素蛋白序列信息,利用Expasy、SMART、CBS、SWISS-MODEL、DNAman6.0等生物软件对凝集素蛋白的一级结构、高级结构性质进行全面分析。半夏凝集素的基本结构信息表明其属于稳定的亲水性蛋白,人工神经网络法预测其二级结构含有16个α螺旋,91个β折叠和150个随机卷曲,同源建模分析显示半夏凝集素蛋白序列与模板岩芋凝集素蛋白A链和B链的同源相似度分别达76.15%和84.55%。高级结构信息显示半夏凝集素N端存在跨膜区域和信号肽区域,并且整个蛋白序列中存在多个N-糖基化位点和蛋白激酶磷酸化位点,功能域预测表明半夏凝集素含有两个B型凝集素功能域,每个功能域均含有保守的甘露糖结合位点,并且这些结合位点多位于半夏凝集素蛋白空间构象的外部。通过对半夏凝集素结构性质的预测为进一步实验验证其生物功能和药用机理提供了有益参考。

两种半夏蛋白及凝集素抑制褐飞虱与番茄花叶病毒初报

从半夏与掌叶半夏块茎中用硫酸铵盐析法分离总蛋白后，用亲和层析法纯化凝集素。所得凝集素单体分子量均为12kD，总蛋白主要含有分子量为12kD左右的成分及24kD、46kD的成分，很可能为凝集素的单体及其二聚体和四聚体。凝集素均具有凝集兔血红细胞的活性。总蛋白在1mg／ml时对褐飞虱有显著的致死效应，达80％。总蛋白在1mg／ml或凝集素在0．2mg／ml时对一定浓度的番茄花叶病毒的侵染有显著的抑制作用，达50％-76％。总蛋白的抑制作用应为所含的凝集素成分所致。

掌叶半夏凝集素基因的克隆及亚细胞定位分析

为了克隆掌叶半夏凝集素基因(Pinellia pedatisecta agglutinin,PPA),并对其进行生物信息学分析和亚细胞定位。采用PCR技术扩增掌叶半夏凝集素基因的ORF序列,构建pCAMBIA1300-35S-PPA-e GFP重组载体,导入农杆菌GV3101并在烟草中进行瞬时表达,采用激光扫描共聚焦显微镜观察其亚细胞定位。克隆获得的PPA基因全长由777个核苷酸组成,编码258个氨基酸,含有3个甘露糖结合位点和2个保守的B-lectin结构域,Gen Bank登录号为KF154981,氨基酸序列登录号为AGV40779。序列比对表明,该序列与天南星、滴水珠、花南星和半夏凝集素的氨基酸序列相似性分别为96%,91%,86%和83%。亚细胞定位的结果表明,pCAMBIA1300-35S-PPA-e GFP融合蛋白在细胞核内无分布,而是点状分布在细胞质膜上。为进一步解析掌叶半夏凝集素基因的结构与功能,开展掌叶半夏凝集素抗病虫害机制的研究奠定基础。