应用半套式聚合酶链反应检测禽呼肠孤病毒S1基因的研究

根据禽呼肠孤病毒 S1133毒株 S1基因序列 ,设计合成 XZ11、XZ12和 XZ11、XZ33两对引物 ,用半套式 PCR对 6株禽呼肠孤病毒标准毒株的核酸进行了检测。结果 6株 ARV均可扩增出和预期大小相符 392 bp的 PCR产物 ,而对其他 6种禽病病原核酸的扩增结果均为阴性 ;该半套式 PCR比 RT- PCR更加敏感 ,这种方法可以检测出 1fg的 ARV

用半套式PCR检测蜱和啮齿动物中查菲埃立克体

目的 了解福建西北部林区查菲埃立克体 (Ehrlichiachaffeensis)的存在情况。方法 用 16SrRNA基因特异引物进行半套式PCR ,检测从福建武夷山和宁化采集的蜱类及野生动物中的查菲埃立克体DNA ,然后对有代表性的标本的扩增产物进行克隆和序列测定 ,并与GenBank中注册的核苷酸序列进行同源性比较。结果 从该地区的越原血蜱 ,野鼠(褐家鼠、黄毛鼠、黄胸鼠、社鼠、小家鼠 )和野兔的脾脏和 /或血块中均扩增出了查菲埃立克体的特异片段。越原血蜱成蜱 2 40组 (6 16只 ) ,31组阳性 ,最小阳性率 5 0 %。野鼠脾脏标本 39份 ,2 2份阳性。野鼠和野兔血块标本共 35份 ,14份阳性。 390bp的PCR产物经克隆、测序后分析发现其DNA序列与美国查菲埃立克体分离株对应位置一致。结论 福建西北部林区可能存在人单核细胞埃立克体病的自然疫源地。

利用半套式PCR扩增16S rRNA基因检测牛和猪附红细胞体

根据GenBank收录的猪和牛附红细胞体16SrRNA基因序列设计1对通用引物,在其上游引物内侧又设计1条分别针对猪和牛附红细胞体的特异性引物。以这4条引物对出现附红细胞体病典型症状及疑似症状的猪和牛的血样DNA进行半套式-PCR扩增。结果显示,该反应阳性率为58.3%,低于临床解剖和镜检结果。对该基因的序列测定结果进行分析,表明不同动物附红细胞体的16SrRNA基因同源性在80%以上。从该基因来看,附红细胞体与立克次氏体没有同源性,而与肺炎支原体和穿透支原体亲缘关系较近。

中蜂囊状幼虫病病毒特异性半套式RT-PCR检测方法的建立及应用

基于中蜂囊状幼虫病病毒基因组序列AF469603中的RNA依赖的RNA聚合酶基因,建立该病毒的半套式RT-PCR检测方法。利用建立的方法检测有典型临床症状的病死中蜂幼虫,可扩增到特异的目的片段,序列分析得出,PCR扩增片段与AF469603同源性高于97%,与其他病原无同源性,表明该方法可用于临床诊断和流行病学研究。

半套式PCR检测军团菌方法的建立及应用

目的 建立检测军团菌的分子生物学方法。方法 采用常规PCR对军团菌属 16SrRNA编码区域和嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强子 (mip)基因编码区域进行扩增 ,同时采用半套式PCR对常规PCR的扩增结果进行确证。结果 采用常规PCR对军团菌属 16SrRNA编码区域进行扩增 ,5种军团菌 (包括 3种嗜肺军团菌 )扩增产物均可见6 5 4bp的特异性扩增带 ,非军团菌菌株PCR结果为阴性 ,采用半套式PCR对常规PCR扩增产物进行验证 ,扩增产物均可见 4 30bp扩增带 ;同时采用常规PCR对嗜肺军团菌mip基因编码区域进行扩增 ,3种嗜肺军团菌扩增产物均可见6 4 9bp扩增带 ,非嗜肺军团菌菌株均为阴性 ,采用半套式PCR对常规PCR扩增产物进行验证 ,3种嗜肺军团菌扩增产物均可见 399bp扩增带。敏感性为 10CFU/ml。并且应用此方法成功检测环境水样中分离的疑似军团菌菌株。结论 半套式PCR经济、简便、快速、敏感、特异 ,为军团菌的早期检测、环境监测。

单管半套式RT-PCR法检测贝类中轮状病毒的研究

轮状病毒(Rotavirus)是一种以贝类为载体的重要食源性病毒,目前来说,RT_PCR是贝类中轮状病毒最有效的检测方法,但通常由于病毒含量较低以及贝类中存在大量的PCR抑制物,致使将其运用于实际样本的检测时灵敏度仍较低。在实验室模拟自然环境,以人工播毒的方式使贝类富集轮状病毒,运用单管半套式RT_PCR法进行检测,并将单管半套式RT_PCR与ELISA、RT_PCR的检测灵敏度做了比较,表明单管半套式RT_PCR比ELISA的灵敏度高10 0 0倍,是传统RT_PCR的10倍,有时甚至10 0倍。另外,单管半套式RT_PCR法降低了实验过程中的内源性和外源性污染,使检测所需时间从6h缩短至4 5h ,大大改进和完善了食源性病毒检测方法。并同时以整只贝和仅以贝的消化道为样检测表明,以消化道为样时的病毒检出率和检测灵敏度较高。

应用半套式RT-PCR技术诊断番鸭呼肠孤病毒病

参考GenBank中番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)S1基因序列设计并合成3条引物C1、HP11和HP12,组成半套式RT-PCR,扩增片段为300 bp.应用该半套式RT-PCR对MDRV、禽呼肠孤病毒(ARV)、番鸭细小病毒(MPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸡胚成纤维细胞(CEF)和番鸭胚成纤维细胞(MDEF)培养物进行扩增.结果仅能从MDRV中扩增出300 bp特异片段,而不能从ARV、MPV、GPV、CEF和MDEF细胞培养物中扩增出特异片段;该方法检测灵敏度为1 fg核酸,重复性好.对人工感染和临床疑似病例用病毒分离和半套式RT-PCR进行检测,2种方法符合率为100%.因此,该半套式RT-PCR可以用于番鸭呼肠孤病毒病的临床快速检测.

半套式PCR和DNA探针技术检测Q热立克次体

目的 建立半套式PCR和DNA探针技术由于检测Q热立克次体。方法 依据已知的Q热立克次体的 16S和 2 3SrRNA基因及其间区的序列 ,设计 3条引物 ,建立了扩增 16S 2 3SrRNA基因间区的半套式PCR方法 ,并将扩增片段制成探针 ,建立了斑点杂交技术。结果 10株Q热立克次体分离株均可扩增出 5 72bp的PCR条带 ,而对照菌都为阴性 ,此半套式PCR方法的灵敏度高达 1pg ;用九里株扩增片段标记后制成的探针 ,与 10个Q热立克次体分离株的全DNA呈阳性杂交 ,对照菌为阴性 ,此杂交方法的灵敏度为 0 .5ng。结论 基于Q热立克次体 16S 2 3SrRNA基因间区的半套式PCR和DNA探针技术具有较好的特异性和灵敏度 ,可联合应用于Q热的病原学诊断。

半套式PCR方法检测猪附红细胞体病的建立

建立一种客观敏感的附红细胞体病早期实验室诊断方法。本实验采用已公布的附红细胞体序列设计半套式引物进行PCR扩增,对扩增出得特异性条带进行序列分析。镜检结果阳性率为75%,PCR检测结果阳性率为90%,测序结果与已公布的序列同源性达99.9%。半套式PCR方法比镜检高效准确,适合附红细胞体病的早期诊断。

半套式聚合酶链反应检测牛奶中部分肠道致病菌

目的 建立一套食物中的单核细胞增生性李斯特氏菌、耶尔森氏菌和副溶血性弧菌等肠道致病菌的快速检测方法。方法 采用裂解法提取DNA与各自的三条引物进行二次聚合酶链反应扩增(简称半套式PCR),检测模拟阳性牛奶中部分肠道致病菌。结果 常规PCR能检出100个活菌的存在,在其产物进行半套式PCR检测时有10个活菌存在时即可扩增出特异性产物,提高10倍。最低检测限可达10 cfu(集落形成单位)。结论 本方法具有特异性强、敏感性高、简便快速等特点。

用半套式PCR检测犬瘟热病毒的研究

根据GenBanK中Barrett报道的犬瘟热病毒Onderstepoort弱毒株的附着或血凝蛋白基因序列，设计合成了能扩增760bp基因片段的半套式引物。用异硫氰酸胍—酚—仿一步抽取法提取细胞总RNA进行反转录，再以此产物进行半套式PCR扩增，并筛选出最佳PCR扩增。结果经半套式PCR扩增能得到与设计片段大小相同的产物，并且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒的核酸。敏感性试验表明，此法能扩增出CDV强毒细胞培养物（毒价为10－5.8TCID50／0．1mL）10－6稀释的反转录产物，远高于常规PCR。经初步应用表明，此法可用于天瘟热的临床诊断和实验研究。

半套式原位 PCR 技术在非何杰金氏淋巴瘤 bc1-2/JH 融合基因检测中的应用

本文在实验中建立了半套式原位ＰＣＲ技术，采用一对半引物，两次ＰＣＲ扩增，经外引物扩增的片段又经内引物扩增，既增加了反应的特异性，又增加了敏感性，并能得到丰富的特异性靶序列。对于组织切片中低拷贝基因的检测更赋有意义。

猪胸膜肺炎放线杆菌半套式PCR检测方法的建立及应用

根据1型胸膜肺炎放线杆菌apxⅣA基因3′端序列设计3条引物,建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的半套式PCR方法。筛选了该方法的最佳反应条件,并采用该方法进行临诊检测,比较了不同处理临床样品的检测结果。结果表明,该方法能检测出所有供试血清型APP,不能从猪上呼吸道常见细菌基因组DNA中扩增出条带,特异性好;最低DNA检出量为16.5 fg,其灵敏性是常规PCR方法的1 000倍;重复性试验结果表明,该方法稳定可靠。应用半套式PCR方法检测临床样品,检出率显著高于细菌分离鉴定;样品保存方法和核酸抽提方法能影响阳性样品的检出率。

布鲁菌病半套式PCR检测方法的建立

目的建立布鲁菌属半套式PCR检测方法。方法根据布鲁菌BCSP-31蛋白基因设计三条引物,扩增目的片段长223 bP,通过条件优化,建立了布鲁菌属半套式PCR检测方法。利用所建立的PCR方法对六个种布鲁菌和Y.Center O:9,S.TyPh i,E.Coli O:157进行检测验证其特异性,通过对活菌计数检测验证其敏感性。结果检测结果表明六个种布鲁菌均可扩出223bP的目的片段,而Y.Center O:9,S.TyPh i和E.Coli O:157不能扩出目的片段。通过对活菌计数最低可检测到20个细菌。结论本研究建立了敏感、特异的布鲁菌病半套式PCR快速检测方法,为布鲁菌的检测和试剂盒的研制奠定了基础。

羊传染性脓疱病毒半套式PCR检测方法的建立及应用

根据羊传染性脓疱病毒F1L基因序列设计3条引物,建立了一种能鉴别诊断羊传染性脓疱病毒和绵羊痘病毒、山羊痘病毒的半套式PCR快速检测方法。采用该方法对羊传染脓疱病毒XC13株进行检测,结果半套式PCR扩增出450bp的特异性DNA片段,而对山羊痘病毒、绵羊痘病毒、禽痘病毒的扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,所建立的PCR方法能检出3.64×101 copies/μL羊传染性脓疱病毒;重复性试验、临床样品检测试验结果表明,所建立的半套式PCR检测方法可用于羊传染性脓疱病毒感染的快速诊断与流行病学调查。

风疹病毒气溶胶的逆转录－半套式PCR检测

将已知浓度的风疹病毒液通过ＴＫ发生器进行气溶胶发生于气溶胶转鼓中，搅匀后用ＡＧＩ－１０和Ｃａｓｅｌｌａ采样器进行气溶胶采样，采样样品以不同浓度稀释后分别进行ＲＴ－ＳＮ－ＰＣＲ和细胞培养。敏感性试验结果表明１００ＴＣＩＤ（５０）的ＲＶ病毒仍可被ＲＴ－ＳＮ－ＰＣＲ检测到，扩增片段为２９３ｈＰ，经ＨｉｎｃⅡ酶切成１２１和１７２ｈＰ的酶切片段与理论设计吻合。相应的Ｖｅｒｏ细胞培养结果均为阴性。通过气溶胶耐喷和耐压试验证明ＲＶ在空气采样过程中因高压冲击衰亡。ＰＣＲ检测微生物核酸，可不过多地考虑其生物衰亡，只要靶基因存在即有检测的可能性。

家兔魏氏梭菌的分离与半套式PCR鉴定

魏氏梭菌病是危害养兔业的重要疾病。某养兔场发生一种以急性黑色水样腹泻或排带血的胶冻样粪便、盲肠出血、胃粘膜出血为主要特征的传染病,通过病原菌的分离培养、形态染色观察、生化鉴定和半套式PCR反应,分离出一株魏氏梭菌。通过药物敏感实验筛选出了敏感药物。实验结果为该病的正确防控措施的提出提供了参考。