半定量RT-PCR测定中药成分对小鼠脾T细胞IL-2mRNA水平的影响

应用半定量RT-PCR方法,测定了9种中药成分对小鼠脾脏T细胞IL-2mRNA水平的影响。结果显示,体内注射黄芪多糖、淫羊藿多糖、当归多糖、蜂胶黄酮和黄芪皂甙能够使ConA诱导的小鼠脾T细胞IL-2mRNA水平显著升高,蜂胶多糖、板兰根多糖、人参皂甙、淫羊藿黄酮不能影响细胞内IL-2mRNA丰度;中药成分体外诱导时与体内应用时的作用效应相同,但与对照相比较,蜂胶多糖在体外能够显著促进IL-2mRNA的诱生,与体内不同。

半定量RT-PCR方法检测热应激对鲫鱼肝脏中HSP70 mRNA含量的影响

依据GenBank已公布的鲫鱼热激蛋白70(Heat shock protein70,HSP70)和beta-actin mRNA序列,分别设计两对引物,应用半定量RT-PCR方法检测应激处理后不同恢复时期鲫鱼(Carassius auratus)肝脏中HSP70 mRNA的表达情况。结果表明,诱导后肝脏组织中HSP70 mRNA的表达量呈现时间依赖性,存在先升高后回落的趋势。在诱导后1h即有所升高,在4h时达到最高值,之后逐渐降低,至48h,表达量降至最初值。研究结果为鲫鱼HSP70的研究提供了基础数据,也为将HSP70用作鱼类生理状态的诊断提供了理论依据。

聚丙烯酰胺凝胶银染技术在半定量RT-PCR中的应用

目的 :探讨聚丙烯酰胺凝胶银染技术在半定量RT PCR中的应用。方法 :提取正常组大鼠和链脲佐菌素致糖尿病模型组大鼠心肌组织总RNA ,逆转录得到cDNA第一链 ,以此为模板进行PCR扩增 ,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和DNA银染技术分析不同循环数及模板量与PCR产物量间的关系。结果 :PCR扩增反应在第 2 0～ 2 5个循环 ,起始模板量为 0 8～ 2 4 μg时 ,PCR产物量与起始模板量呈现较好的线性关系。 结论 :通过控制起始模板量 ,减少PCR循环数使目的基因的扩增处于PCR扩增指数期 ,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和DNA银染技术 。

半定量RT-PCR检测细胞因子表达的研究

目的 :建立一种客观、敏感的检测IL 2 /IL 4细胞因子基因表达变化的方法。 方法 :采用TRIzol试剂提取免疫排斥 /免疫耐受大鼠脾脏组织总RNA ,分光光度计法定量。取 2 μg总RNA ,采用RT PCR法逆转录 扩增IL 2、IL 4和内参照 β actincDNA ,扩增产物经电泳分离后 ,用凝胶图像分析仪照相和扫描分析 ,检测其相对表达量。 结果 :RT PCR产物经电泳后 ,β actin、IL 2和IL 4分别在 2 2 6bp、342bp和 332bp处出现明显条带 ,与预定条带大小相一致 ;免疫耐受组IL 4与免疫排斥组IL 2的表达有明显差异 ,在免疫耐受组中IL 4表达增高 ,而在免疫排斥组中IL 2表达增高 ,内参照 β actin扩增条带亮度在两组中相同 ,PCR产物量与扩增初始模板量之间存在良好的对应关系。 结论 :半定量RT PCR检测是一种从少量细胞中快速、简便。

应用半定量RT-PCR方法测定围产期奶牛肝PEPCK-C mRNA的丰度

建立了奶牛肝PEPCK-CmRNA丰度的半定量RT-PCR检测方法，其优化的PCR反应条件（25pL）为：57C退火、2．4mmol／L Mg^2＋、26～28个循环数、cDNA不小于2．6mg／L、2：1的PEPCK-C／β-actin引物比。同时，应用该方法检测了围产期奶牛肝中PEPCK-CmRNA丰度，结果显示：产前低血糖奶牛肝PEPCK-C mRNA丰度显著低于对照组，但是产后却高于对照组。围产期奶牛血糖水平与肝PEPCK-C mRNA丰度之间的相关系数，对照组为0．68（P=0．14），低血糖组为0．82（P=0．047）。因此，围产期奶牛肝PEPCK-CmRNA丰度对奶牛血糖浓度具有调节作用，低血糖奶牛表现得更为明显。

绵羊MC4R基因的半定量RT-PCR及生物信息学分析

本研究旨在对绵羊MC4R基因进行组织表达谱和生物信息学分析。参考牛MC4R基因序列设计引物,采用PCR技术克隆绵羊MC4R基因序列,并利用半定量RT-PCR进行组织表达谱分析;同时对其进行生物信息学分析。结果表明,克隆的绵羊MC4R基因全长1 919 bp,含有999 bp的完整CDS编码区,编码332个氨基酸。其CDS编码区的核苷酸序列与牛、人、猪、大鼠、小鼠MC4R基因对应序列的同源性分别为95.2%、68.8%、82.7%、76.6%、77.1%,预测的氨基酸序列同源性分别为97.0%、92.8%、93.7%、92.2%、91.6%。组织表达谱分析表明MC4R基因在各组织均不同程度的表达,其中在大脑表达量很高,其他组织较低。生物信息学预测MC4R蛋白功能发现,绵羊的MC4R蛋白存在7个跨膜螺旋结构域,同时预测MC4R存在10个磷酸化位点和1个特异性蛋白激酶磷酸化位点。结果表明,MC4R是一个非常保守的蛋白,在绵羊的生长发育中起着重要作用。

水分胁迫下小麦类脱水素基因表达的半定量RT-PCR分析

以‘郑引1号’小麦为材料,经水分胁迫后进行RT-PCR扩增,结果在胁迫条件下获得500bp的脱水素基因(wzy1-1)。利用半定量RT-PCR方法,分析‘陕合6号’和‘郑引1号’小麦在正常供水条件下及PEG6000胁迫后18、24和42h,以及复水6和12h时wzy1-1在叶片中的表达。结果表明:2个小麦品种中wzy1-1在水分胁迫后18h均有表达,至胁迫24、48h时表达量较18h均有所增多;复水6h后该基因表达迅速降低,至复水后12h表达消失。且该基因在‘陕合6号’(抗旱性较强)叶片中表达量较‘郑引1号’(抗旱性较弱)高,表明该基因的表达与小麦的抗旱性密切相关。

黄瓜RGA基因的半定量RT-PCR表达分析

以黄瓜(Cucumis sativusL.)抗霜霉病品种东农129为材料,利用RT-PCR半定量法研究了接种霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensisRostow)、喷施水杨酸(SA)和氯化钙(CaCl2)等不同处理对黄瓜抗病基因类似序列(RGA)表达的影响.结果表明:CsRGA1和CsRGA5基因的表达受霜霉病菌的侵染而启动或加强,外施SA和CaCl2都能够增强其表达;CsRGA4和CsRGA8属于组成型表达基因,其表达可能与霜霉病菌的侵染无关;CsRGA2的表达与外施SA和CaCl2缺乏密切关联.

半定量RT-PCR检测JWA基因在慢性粒细胞性白血病的表达

目的 探讨JWA基因表达与慢性粒细胞性白血病 (CML)的相关意义。方法 应用半定量RT PCR技术检测 2 6例CML患者骨髓和 /或外周血JWA基因的表达。结果 JWA基因表达在CML慢性期高达 15 / 18例 ;而急变期 (含加速期 )为 2 / 8例。结论 JWA基因的下调可能与CML急变的某个过程相关 。

甘薯NPR1基因半定量RT-PCR检测方法的建立

为进一步研究甘薯病原微生物的侵染对甘薯病程相关非表达子1基因(NPR1)表达的影响,以甘薯肌动蛋白(β-ac-tin)基因为内参照基因,提取甘薯叶片总RNA,反转录为cDNA,同批异管对该2个基因进行PCR扩增.通过对循环数的优化和对体系重复性、准确性的分析,建立了一个稳定、方便的半定量RT-PCR体系.

半定量RT-PCR法检测低磷胁迫下大豆根系质膜H^+-ATPase基因的表达

试验以大豆为材料,采用水培方法,以β-微管蛋白基因为内参基因,用半定量逆转录聚合酶链式反应(se-mi RT-PCR法)检测在低磷胁迫下大豆根系质膜H+-ATPase基因表达量的变化,以期建立适于检测该基因表达的semi RT-PCR试验体系。结果表明:在低磷胁迫2 h时,与对照相比基因表达量有所增加,在4 h时相对表达量达到最大,6 h略有下降。这表明大豆根系质膜H+-ATPase基因表达量的增加可能与适应低磷胁迫的逆境有关,半定量RT-PCR法可以用来检测特定基因在不同条件下的表达量。

用荧光半定量RT-PCR检测蚊溴氰菊酯抗性

目的:建立蚊对菊酯类杀虫剂抗性的PCR检测方法。方法:应用荧光半定量RT鄄PCR,检测经SSH结合cDNA芯片分离鉴定的淡色库蚊对溴氰菊酯抗性相关基因NYD鄄Tr在抗性品系与敏感品系中的表达水平。结果:经荧光半定量RT鄄PCR检测,NYD鄄Tr进入指数期的循环数抗性品系早于敏感品系,抗性品系组比敏感品系组先进入指数增长期。结论:以NYD鄄Tr作为靶基因,荧光半定量RT鄄PCR可区分淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系与敏感品系,亦即可检测淡色库蚊溴氰菊酯抗性。

疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因ME281半定量RT-PCR分析

以从疣粒野生稻受白叶枯病菌诱导所建的差减文库中筛选出的一个具有CC-NBS-LRR抗病结构域的基因(克隆号为ME281),用半定量RT-PCR法,以肌动蛋白(β-actin)基因为内参,研究疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因ME281基因mRNA的表达水平。通过对PCR体系中循环次数及Mg2+浓度的优化,最终建立了一个稳定、方便的半定量RT-PCR体系。通过ME281基因与β-actin基因PCR产物的灰度之比,确定ME281为诱导性表达,并进一步推测其为疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因,甚至为抗病基因。

小麦ArfGAP基因的克隆、半定量RT-PCR分析及原核表达

为明确小麦ArfGAP基因在非生物胁迫中所行使的功能,采用电子克隆技术分离普通小麦ArfGAP基因后对其在不同非生物胁迫下的表达特性进行了分析,并在大肠杆菌中表达了该基因。结果表明,从扬麦18号中克隆得到的TaArfGAP基因ORF全长为2 121bp。生物信息学分析表明,TaArfGAP蛋白氨基端方向存在一个典型的ArfGAP蛋白结构域,在亲缘关系上与山羊草、乌拉尔图小麦和短柄草较近,而与甘蓝等作物关系较远。半定量RT-PCR分析表明,TaArfGAP基因在干旱、PEG和NaCl胁迫下显著上调表达,但在高温条件下则显著下调表达。SDS-PAGE检测结果表明,IPTG终浓度为0.8~1.0mmol·L-1、诱导温度为24℃及诱导时间为10h时,在分子量大小为81kD左右可以得到较大的可溶性表达蛋白量,且与预期结果一致,说明TaArfGAP基因在原核表达体系中成功表达。

半定量RT-PCR检测口腔鳞状细胞癌死亡相关蛋白激酶的表达

采用半定量RT-PCR的方法检测死亡相关蛋白激酶(death associated protein kinase,DAPK)基因在口腔鳞状细胞癌(Oralsquamous cell carcinoma,OSCC)中的表达,探讨DAPK基因的表达与OSCC的关系,结果显示DAPK基因的表达在OSCC组织中显著降低,该基因可能与OSCC的发生、发展有关,可作为OSCC诊断的检测指标。

半定量RT-PCR检测原发性肝癌cyclinB1的表达和意义

目的探讨cyclin B1在肝癌组织的表达和意义。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测35例肝癌组织、配对癌旁组织及5例正常肝组织cyclin B1mRNA,以GAPDH为内参照。结果31例(88.6%)肝癌组织及相应癌旁组织、3例(60%)正常肝组织cyclin B1mRNA呈阳性表达,三者比较无统计学意义(P>0.05)。癌组织cyclin B1mRNA表达水平x-±s(0.517±0.015)显著高于癌旁组织(0.282±0.023)和正常肝组织(0.173±0.011)。但癌旁组织与正常肝cyclin B1mRNA表达水平无显著性差异(P>0.05)。结论相对于癌旁组织和正常肝组织,肝癌组织cyclin B1mRNA表达水平明显增强,cyclinB1可能在肝细胞癌变过程中发挥作用。

绵羊BTG1基因的半定量RT-PCR及生物信息学分析

B细胞易位基因1(BTG1基因)是BTG/TOB基因家族的成员之一,在动物细胞的增殖和分化中起重要的作用.利用牛BTG1基因的mRNA序列与绵羊的EST数据库进行Blast检索,并通过序列拼接和逆转录RT-PCR方法首次获得绵羊BTG1基因的部分cDNA序列(GenBank登录号FJ444829),其片段长度为1 358 bp,包括完整的开放阅读框516 bp,编码171个氨基酸.半定量PCR研究结果表明:BTG1基因在小尾寒羊和陶赛特羊的10种组织中均表达,并具有一致的表达趋势.同源分析结果表明,绵羊BTG1蛋白的氨基酸序列中存在BTG/TOB的保守结构域,并且该蛋白在不同物种间具有很高的保守性.通过生物信息学预测BTG1蛋白功能,发现绵羊BTG1蛋白存在1个跨膜结构域、8个磷酸化位点和1个特异性蛋白激酶磷酸化位点.蛋白质结构同源建模分析表明,绵羊BTG1蛋白具有BTG/TOB蛋白家族的典型空间结构.

疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因ME196半定量RT-PCR分析

以从疣粒野生稻受白叶枯病菌诱导所建的差减文库中筛选出的一个具有丝氨酸一苏氨酸激酶抗病结构域的基因(克隆号为ME196),用半定量RT-PCR法,以肌动蛋白(-βactin)基因为内参,研究疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因ME196基因mRNA的表达水平。通过ME196基因与-βactin基因PCR产物的灰度之比,确定ME196为诱导性表达,并进一步推测其为疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因,甚至为抗病基因。

半定量RT-PCR方法研究microRNA393在旱处理后的孕穗期水稻叶片和穗部的表达情况

microRNAs是新近发现的一类具有重要功能的小分子RNA。研究表明,一些mi RNAs与植物抗逆反应相关。本文使用半定量RT-PCR的方法,研究了mi R393在旱处理后的孕穗期水稻叶片和穗部的表达情况。结果发现,mi R393在胁迫后的叶片和穗部表达上调。同时也发现,mi R393在胁迫前后穗部的表达略高于其在叶片中的表达。实验结果也表明,半定量RT-PCR适用于分析mi RNAs的表达。

猪繁殖与呼吸综合征病毒主要结构蛋白基因半定量RT-PCR方法的建立及其在RNA干扰研究中的应用

为了建立以GAPDH基因为参照的半定量RT-PCR检测方法,根据PRRSV VR2332株病毒基因组和GAPDH序列设计4对特异性引物,分别扩增GP5、M、N和GAPDH基因序列,将shRNA表达质粒和GP5、M、N真核表达质粒共转染HEK293A细胞,应用该法检测了转染孔中GP5、M、N的相对表达量。同管和分管扩增法均建立了以GAPDH基因为参照的半定量RT-PCR检测方法。靶向GP5、M和N蛋白基因的shRNA表达质粒对其各自蛋白的抑制率为36%～69%,其中pSi-N3和pSi-G1抑制效果最为显著。结果表明,建立的半定量RT-PCR可以用于PRRSV主要结构蛋白基因表达水平的检测分析中。