荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应检测大鼠死后肾mRNA

目的探讨荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应(fluorescencesemi-quantitativereversetranscrip-tase-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测大鼠死后不同时间肾3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA含量变化对死亡时间(postmorteminterval,PMI)推断的应用价值。方法28只大鼠断颈处死后置于20℃温控系统内,利用荧光标记半定量RT-PCR技术检测大鼠肾GAPDHmRNA在死后48h内相对表达量的变化情况。结果在死后即刻至40h内大鼠肾均可检测出GAPDHmRNA,且其扩增产物呈规律性下降。结论荧光半定量RT-PCR技术检测大鼠死后肾GAPDHmRNA含量变化对PMI推断具有一定的应用价值。

正交设计优化半夏相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应体系

目的采用正交设计优化半夏SRAP-PCR的反应体系。方法以半夏基因组DNA为模板,应用L_(16)(4~5)正交表,研究了Taq酶、Mg^(2+)、随机引物、dNTPs和模板DNA 5种SRAP反应组分浓度变化对扩增结果的影响。结果优化反应体系为:25μL反应体系中含有buffer2.5μL、Taq酶1.0U、Mg^(2+)2.5mmol/L、引物0.8μmol/L、dNTPs0.1 mmol/L、模板DNA 50 ng。结论正交设计能客观高效的优化半夏SRAP反应体系。

IgA肾病患者β1,3-半乳糖基转移酶特异性伴侣蛋白Cosmc基因编码区的序列分析(英文)

背景:IgA肾病发病机制迄今不明,目前研究证实IgA肾病患者IgA1分子铰链区β1,3-半乳糖基转移酶的活性降低引起IgA1分子O-糖基化异常是该病发生的重要途径。作者前期研究推测IgA肾病患者外周血B淋巴细胞β1,3-半乳糖基转移酶特性伴侣蛋白Cosmc表达降低可能是IgA肾病糖基化异常原因的中心环节。目的:检测IgA肾病患者β1,3-半乳糖基转移酶特异性伴侣蛋白Cosmc基因编码区的DNA序列,并与Gene Bank公布的序列比对。设计:病例-对照观察。单位:四川大学华西医院肾内科。对象:选择2005-11/2006-08四川大学华西医院肾内科收治的肾病患者37例,包括IgA肾病患者27例和非IgA肾病患者10例,另选择5例健康自愿者,所有观察对象均知情同意。方法:实验于四川大学生物治疗国家重点实验室完成。采集所有观察对象的肝素钠抗凝外周静脉血2mL,采用经典酚氯仿法提取外周血基因组DNA,应用紫外分光光度仪定量DNA的含量,应用聚合酶链反应扩增所有观察对象的β1,3-半乳糖基转移酶特异性伴侣蛋白Cosmc基因编码区,并对每个观察对象的聚合酶链反应产物进行直接测序,将所有测序结果分别与GeneBank公布序列一一进行比对。主要观察指标:β1,3-半乳糖基转移酶特异性伴侣蛋白Cosmc基因编码区的聚合酶链式反应产物扩增结果及测序序列。结果:①Cosmc基因的编码区位于Cosmc基因的257-1213位,扩增后的Cosmc基因大小为1247bp。②IgA肾病患者、非IgA肾病患者以及健康自愿者之间的β1,3-半乳糖基转移酶特异性伴侣蛋白Cosmc基因编码区序列均一致,并与GeneBank公布的序列无差异。结论:未发现IgA肾病患者有Cosmc基因编码区序列异常,提示Cosmc基因编码区序列与IgA肾病IgA1分子的糖基化异常可能无关。

半定量RT-PCR法检测赤霞珠葡萄白藜芦醇合酶STS基因的表达

以赤霞珠葡萄(Vitis vinifera L.)为材料,以Actin基因为内参,采用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测葡萄果实发育过程中白藜芦醇合酶(STS)基因表达量的变化,以期建立适于检测该基因表达的RT-PCR试验体系。结果表明,在退火温度58℃,扩增循环31次的时候,STS基因能够进行较好的扩增。在赤霞珠葡萄浆果发育的过程中,花后20、50 d STS基因表达量较少,在花后80 d表达量增到最大,花后110 d又降低。

用半定量RT-PCR方法分析小麦TaMlo-A1c基因的表达

以小麦稳定表达的肌动蛋白基因(Actin)作为对照,利用半定量反转录聚合酶链式反应(Semi-QRT-PCR)技术,对与抗白粉病有关的小麦(TriticumaestivumL.)TaMlo-A1c基因的表达进行了研究。结果发现:TaMlo-A1c基因在小麦的叶、茎、根中均表达,穗中不表达,在白粉菌(Blumeriagraminis(DC.)E.O.Speerf.sp.triticiEm.Marchal,Bgt)诱导不同时间后小麦叶片中的表达稍微有所增强。研究表明,用半定量RT-PCR技术研究小麦基因表达,具有特异性高、操作简便和可靠性强的优点。

用半定量RT-PCR法分析基因表达水平的影响因素

半定量逆转录聚合酶链式反应(Semi-QRT-PCR)以其灵敏、简捷及特异性高等优点已逐渐成为分析基因表达水平的一种有效手段。着重对用半定量RT-PCR法分析基因表达水平的相关影响因素进行了综合论述,并讨论了半定量RT-PCR法在基因表达研究方面的应用潜力。

嵌套式PCR扩增SRY基因序列鉴定牛胚胎性别体系的建立

应用源自牛X和Y染色体同源区的1对外引物P1、P2及其各自特异区的2对内引物P3、P4和P5、P6,进行嵌套式PCR反应,对中国荷斯坦公、母牛静脉血样DNA及牛胚胎样DNA进行特异性条带的嵌套式PCR扩增,并对外、内嵌套式引物的PCR反应体系进行了优化,以准确鉴定牛早期胚胎性别。结果表明,在优化了的PCR反应体系下,中国荷斯坦公牛DNA样品得到178bp和262bp的两个条带,而母牛仅得到262bp的1个条带;静脉血样DNA性别鉴定结果与实际性别相符率为100%,表明本试验建立的体系完全可以用于牛早期的胚胎性别鉴定。

猪圆环病毒3型半巢式PCR方法的建立和应用

为建立快速检测猪圆环病毒3型(PCV-3)的方法,以Gen Bank上登陆的我国PCV-3全基因组为参考毒株,设计3条引物,建立了PCV-3半巢式PCR诊断方法。本方法可以扩增出大小为249 bp的特异性条带,与预期大小一致,而猪圆环病毒1型和2型、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒等对照样品均未扩增出特异性条带。将PCV-3的阳性DNA稀释后作为模板,发现半巢式PCR的检测极限可以达到5×10^(-3)μg/m L。对临床80份样品进行检测,发现半巢式PCR的阳性检出率可以达到27.5%(22/80),而常规PCR的检出率仅为6.25%(5/80)。检测结果表明,本文建立的半巢式PCR方法较为准确、特异和敏感,适用于PCV-3的快速检测和流行病学调查。

猪胸膜肺炎放线杆菌半套式PCR检测方法的建立及应用

根据1型胸膜肺炎放线杆菌apxⅣA基因3′端序列设计3条引物,建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的半套式PCR方法。筛选了该方法的最佳反应条件,并采用该方法进行临诊检测,比较了不同处理临床样品的检测结果。结果表明,该方法能检测出所有供试血清型APP,不能从猪上呼吸道常见细菌基因组DNA中扩增出条带,特异性好;最低DNA检出量为16.5 fg,其灵敏性是常规PCR方法的1 000倍;重复性试验结果表明,该方法稳定可靠。应用半套式PCR方法检测临床样品,检出率显著高于细菌分离鉴定;样品保存方法和核酸抽提方法能影响阳性样品的检出率。

胶质瘤中膜型基质金属蛋白酶1mRNA水平表达

目的探讨胶质瘤恶性程度和膜型基质金属蛋白酶1(MT1-MMP)mRNA表达水平的关系,为胶质瘤的诊断、治疗及预后等提供参考。方法分别采用实时荧光定量逆转录PCR法(RT-PCR)和半定量RT-PCR法检测34例胶质瘤和7例正常脑组织中MT1-MMPmRNA的表达水平。结果实时荧光定量RT-PCR法检测正常脑组织和II级(低级别)、III级、IV级、高级别(III、IV级)胶质瘤的△△Ct值分别为0.834±0.517,4.063±2.309,6.376±4.023,7.653±4.196和7.072±4.072。半定量RT-PCR法测定结果显示,正常脑组织和II级、III级、IV级、高级别胶质瘤的相对灰度值分别为0.799±0.156,1.142±0.158,1.538±0.482,1.652±0.376和1.600±0.421。正常脑组织和II、III、IV级胶质瘤之间,II、IV级胶质瘤之间,正常脑组织和低、高级别胶质瘤之间,低、高级别胶质瘤之间MT1-MMP基因mRNA表达水平均有显著性差异。结论胶质瘤中存在MT1-MMP基因mRNA高水平的表达,随着肿瘤恶性程度的增加,MT1-MMP基因mRNA的表达水平增高。

检测AML多药耐药基因mRNA表达的多重半巢式逆转录PCR方法的建立

目的建立多重逆转录和半巢式PCR的方法检测急性髓性白血病(AML)多药耐药(MDR)基因mRNA表达。方法分别设计针对5种MDR基因和1种内参照基因的特异性引物,采用多重逆转录和半巢式PCR检测耐药细胞株HL60/VCR和难治性AML患者骨髓标本中的MDR基因mRNA表达。结果应用此多重逆转录和半巢式PCR反应系统,可以特异的在一个反应管内同时检测到5种耐药基因。结论该方法对于检测AML患者MDR基因mRNA表达具有快速、灵敏、简便等特点,能快速同时分析大量样本,对MDR研究、诊断和治疗有一定应用前景。

基质金属蛋白酶2及其组织抑制因子1在子宫内膜异位症中的表达及其意义

目的探讨基质金属蛋白酶2(MMP-2)及其组织抑制因子1(TIMP-1)mRNA在子宫内膜异位症异位内膜和在位内膜中的表达及其意义。方法分别选取子宫内膜异位症患者异位内膜组织40例、在位内膜组织18例和对照组正常内膜组织20例作为研究对象,应用半定量逆转录-聚合酶链式反应技术检测MMP-2、TIMP-1 mRNA的表达。结果MMP-2 mRNA在异位内膜的表达强度为0.58±0.11,明显高于在位内膜的0.47±0.09和正常内膜的0.45±0.08,差异均有统计学意义(P﹤0.05和﹤0.01);TIMP-1 mRNA在异位内膜的表达强度(1.57±0.70)明显低于在位内膜(2.21±0.95)和对照组内膜(2.38±0.78),差异均有统计学意义(均P﹤0.01)。结论子宫内膜异位症患者异位内膜组织中MMP-2 mRNA表达增强可能促进异位内膜的种植,TIMP-1 mRNA表达减弱可能促进内膜异位病变的发展。

雌孕激素对SMMC-7721人肝癌细胞α-1,6岩藻糖基转移酶的调控

目的 探讨雌孕激素在肝癌细胞中对于α - 1 ,6岩藻糖基转移酶表达的调控。方法 通过对SMMC- 772 1细胞分别按不同时间点和不同浓度给予雌二醇和孕酮处理 ,观察细胞生长状态和形态学的改变 ,并进行半定量逆转录 -聚合酶链式反应和小扁豆凝集素 (LCA)印迹分析以检测α - 1 ,6岩藻糖基转移酶基因 (FUT8)转录水平和底物蛋白核心岩藻糖基化水平的改变。结果 雌激素能明显上调FUT8基因的转录 ,并显著提高Mr 为1 35× 1 0 3 、1 0 0× 1 0 3 和 6 0× 1 0 3 LCA反应阳性的糖蛋白的表达水平 ,同时改善了细胞的生长状态 ;而孕激素则可以明显下调FUT8基因的转录 ,并显著降低Mr 为 1 35× 1 0 3 、1 1 5× 1 0 3 、1 0 0× 1 0 3 和 6 0× 1 0 3 的LCA反应阳性的糖蛋白的表达水平 ,同时改变了细胞的正常形态。结论 雌孕激素能通过调节α - 1 ,6岩藻糖基转移酶的表达 ,改变靶蛋白的核心岩藻糖基化修饰 ,从而参与肿瘤的发生发展过程。

宫颈病变组织中端粒酶反转录酶基因表达的临床意义

目的探讨宫颈病变组织中端粒酶反转录酶(TERT)基因的表达和临床意义。方法对获取的208例宫颈脱落细胞标本进行细胞学诊断、组织学诊断,同时采用RT-PCR方法检测TERT基因的扩增情况。结果不明确意义鳞状上皮细胞(ASCUS)组、低度病变(LSIL)组、高度病变(HSIL)组、鳞状细胞癌(SCC)组与正常细胞学组比较,组间差异有统计学意义(χ2=16.441,P<0.0025);CIN1、2、3,SCC组与良性病变组TERT基因阳性率比较差异有统计学意义(P<0.001);TERT基因的表达率与细胞学诊断的病变程度呈正相关(R=0.342,P=0.0442<0.05),TERT基因的表达率与组织学诊断的病变程度呈正相关(R=0.527,P=0.0411<0.05)。结论TERT基因在宫颈癌和CIN病变中的表达有异常增加,可作为监测宫颈癌前病变病情进展的一个生物遗传学指标。

鹿源狂犬病野毒8202株基因型的研究

为了从基因水平确定鹿源狂犬病野毒8202株与其它狂犬病病毒的进化关系,应用RT-半嵌套式PCR技术,利用3条引物对病毒的核蛋白基因进行扩增、克隆及序列测定,并与已发表的狂犬病病毒株3aG、PV、CVS、HEP-Flury、RC-HL、Nishigahara、SADB19的核蛋白基因进行了比较分析。结果表明,8202株与其它7个病毒株均来源于同一个进化枝,属于基因Ⅰ型。

石蜡包埋组织Real-time PCR检测技术在侵袭性曲霉菌病诊断中的应用价值

目的:探讨石蜡包埋组织实时聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测技术诊断侵袭性曲霉菌病(IA)的应用价值。方法:回顾性分析2021年1月—2023年12月山东省公共卫生临床中心经病理诊断IA患者200例,对其住院期间的石蜡包埋组织进行Real-time PCR检测,查阅半乳甘露聚糖(GM)试验结果,绘制Real-time PCR的受试者工作特征(ROC)曲线,计算ROC曲线下面积,制定最佳临界值,计算不同PCR和GM诊断条件下的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。结果:石蜡包埋组织Real-time PCR检测结果的敏感度为98.0%,特异度为100.0%,血清GM试验结果显示,敏感度为72.5%,特异度为94.0%;Real-time PCR检测用于IA诊断烟曲霉菌效能最好,其ROC曲线下面积为0.890(P=0.039),当荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)循环数值为34.30时,敏感度(89.0%)和特异度(92.0%)为最佳值。结论:石蜡包埋组织Real-time PCR检测技术对IA具有较高的诊断价值,其敏感度和特异度均高于GM试验。

进口锦鲤暴发病病原的nested-PCR鉴定

为了查明锦鲤暴发性疾病的病因 ,将患病锦鲤的脑、肝、脾和肾等组织悬液接种到CO、CK和EPC等鱼类细胞系中培养 ,均未发现细胞病变 ;从病灶中取样进行病原菌的分离和培养 ,证明锦鲤有副溶血弧菌和嗜水气单胞菌的感染。制备锦鲤疱疹病毒 (KHV)的 2对引物KHV9/ 5F和KHV9/ 5R ,KHV1和KHV2 ,用嵌套式聚合酶链式反应 (nested -PCR)在脑和脾脏组织的抽提物中扩增出长度为 4 12bp的特异性的DNA片段。将该片段的nested -PCR扩增产物纯化后 ,克隆、测序。用NCBI -Blast软件将测序结果在Genebank中进行搜寻、比较 ,结果发现与注册号为AF4 1180 3的KHV基因序列的一部分片段有 99%的同源性。因此初步判断这次锦鲤暴发性疾病是由KHV引起的 。

转基因玉米59122品系的特异性检测

使用反向聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了转基因玉米59122的外源基因与玉米基因组之间的两段侧翼序列,并据其左侧侧翼序列设计了具品系特异性的引物,运用半巢式PCR技术建立了59122的品系特异性二重PCR检测方法,扩增片段100bp,横跨pat终止子与转基因玉米侧翼基因之间。以转基因玉米59122、MON863、MON810、GA21、NK603,转基因大豆Roundup Ready和转基因油菜GT73等为材料,证明本方法与其他转基因作物具有高特异性。本方法在检测59122时,确定出连接体系中线性DNA的最佳质量浓度为1ng/μL左右,检出限达到0.1%,灵敏度为38个单倍体基因组拷贝数。因此可准确、快速、高效地检测转基因玉米及其产品,或作为常规PCR定性检测后的验证方法。

从补肾生血药对衰老小鼠骨髓GM-CSF基因转录水平的影响探讨肾生髓的分子基础

目的 :为探讨肾生髓的分子基础 ,阐述肾生髓的本质相关基因 ,我们观察了补肾生血药对衰老小鼠骨髓粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)基因转录水平的影响。方法 :采用老年小鼠和D 半乳糖致衰老小鼠两种衰老肾虚动物模型 ,分别连续灌服补肾生血药 2个月和 1个月 ,应用半定量逆转录 聚合酶链式反应技术 (RT PCR)检测小鼠骨髓有核细胞GM CSF基因转录水平的变化。结果 :老年小鼠和D 半乳糖致衰老小鼠骨髓有核细胞GM CSF基因转录水平明显低于青年小鼠和正常对照小鼠 ,给药后则可明显得到提高。结论 :补肾生血药起到滋阴补肾、益髓生血作用的分子机理之一 ,是促进骨髓GM CSF基因的转录 ,GM CSF是肾生髓的分子基础之一 ,GM CSF基因是肾生髓的本质相关基因之一。

Ptcor8表达与枳生理落叶及温度的关系

将干径粗度相近的2年生枳实生容器苗60株从田间移入温室(20～25℃),以田间10株为对照.从2008年11月14日至2009年1月3日,每10d从温室随机搬出3株置于田间,研究枳叶片中Ptcor8的表达与枳生理落叶及环境温度的关系.结果表明,温室里的枳冬季不落叶;从温室搬至田间的枳,随着搬出温室时间的延后,其落叶期推迟;12月中旬后搬出温室的枳,即使经历冬季低温也不落叶.在落叶和未落叶的枳叶片中,均能检测到Ptcor8的表达,qPCR结果表明,Ptcor8的表达与枳的生理落叶无关,其表达量的明显增加与骤然降温和持续低温有关,与低温关系密切.