半巢式反转录实时荧光PCR检测马铃薯黑环斑病毒

本研究根据基因组中RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)保守序列,设计合成了3条巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针,建立了半巢式反转录实时荧光PCR检测PBRSV的新方法。该方法采用E.Z.N.ATM快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR和TaqMAN探针检测技术。第二步半巢式反转录实时荧光PCR既是对第一步信号的进一步放大,也是对第一步PCR产物的确认,因此,检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Realtime PCR等方法高。实验结果表明,该方法检测灵敏度可达300fg/μL植物总RNA。

刍议活动性肺结核早期检验中半巢式全自动实时荧光定量PCR检测与涂片抗酸染色法的应用研究

目的评估半巢式全自动实时荧光定量PCR检测与涂片抗酸染色法在活动性肺结核早期检验中的应用效能。方法选取2022年9月—2023年9月于平邑县结核病防治所就诊的90例疑似肺结核患者为研究对象,采用Xpert MTB/RIF技术、涂片抗酸染色法检验及简单法固体培养法同时检测90例疑似肺结核患者痰标本,对检测结果进行比较。结果以固体培养结果作为金标准,痰培养阳性率85.56%,阴性率14.44%。Xpert MTB/RIF阳性率84.44%、阴性率15.56%。涂片抗酸染色法检验阳性率48.88%、阴性率51.11%。Xpert MTB/RIF检验的灵敏度97.40%、准确度96.67%、阳性预测值98.68%以及阴性预测值85.71%均高于涂片抗酸染色法检验50.64%、52.22%、88.64%、17.39%,差异有统计学意义(χ^(2)=43.768、46.722、5.922、22.546,P均<0.05)。结论与涂片抗酸染色法相比,在活动性肺结核早期检验中采用半巢式全自动实时荧光定量PCR检测(Xpert MTB/RIF)的应用效能更高。

应用反转录PCR和实时荧光定量PCR技术判定现场物证生物属性

目的探寻分子生物学方法判定刑事案件现场物证的生物属性的可行性。方法取30份现场生物检材,其中血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)各10份,分别进行常规检验法和分子生物学方法,通过DNA-RNA共提取技术,将其中的mRNA运用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术反转录成cDNA,根据3种生物检材不同的目标基因设计3对特异性引物,进行实时荧光定量PCR扩增,通过熔解曲线测定不同的熔解温度(Tm)和不同长度的扩增片段来区分生物检材。结果血液(斑)的Tm值为(84.5±0.2)℃,片段长度177 bp;唾液(斑)的Tm值为(76.9±0.3)℃,片段长度134 bp;精液(斑)的Tm值为(88.5±0.2)℃,片段长度294 bp。结论与常规检验法比较,联合应用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术判定检材的生物属性特异性强、灵敏度高、结果稳定可靠,可应用于日常法医物证检验。

实时荧光反转录PCR检测呼吸道合胞病毒

目的建立快速、准确、特异的实时荧光反转录PCR方法检测呼吸道合胞病毒(RSV).方法根据RSV基因序列设计引物和探针并优化实时荧光反转录PCR反应体系,对686例临床标本进行检测,阳性结果测序验证.结果本实验所建立实时荧光反转录PCR方法可准确、特异地检测RSV;686名呼吸道感染患儿中RSV感染达到16.5%(113/686).结论本研究建立的RSV实时荧光反转录PCR方法快速、准确,结果可靠,可用于儿童RSV感染的临床诊断.

樱桃病毒A实时荧光定量PCR检测技术的建立与应用

在樱桃病毒A(CVA)mp基因保守区域设计了3对检测引物,经特异性筛选后,获得可用于病毒定量研究的引物。制备质粒标准品,建立标准曲线,同时验证该方法的灵敏度和特异性,并应用于田间果树样品CVA定量检测。最终成功筛选出1对检测效率高、特异性强的引物(CVA-dF2、CVA-dR2),基于SYBR Green I荧光染料建立反转录实时荧光定量PCR检测CVA的方法。该方法重复性好、灵敏度高,无需借助内参基因即可准确检测目的病毒载量,绝对定量标准曲线斜率为-3.5746,决定系数R2为0.9986,扩增效率为0.9044,比常规RT-PCR检测灵敏度高10倍。该方法的建立为CVA定量研究提供了有力工具,可用于果树中CVA批量检测或低丰度病毒样品检测。

人端粒酶催化亚单位mRNA的实时荧光RT-PCR定量检测

目的 :建立可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。方法 :用Trizol 试剂从HepG2细胞中分离总RNA ,然后反转录为cDNA。利用一对基因特异引物和一条TaqManMGB探针 ,以实时荧光PCR定量hTERT的cDNA。同时定量测定人 β 肌动蛋白 (hBA)的mRNA作为内对照。用梯度稀释的克隆的人 β 肌动蛋白基因制作标准曲线。结果 :标准曲线的相关系数为 1.0 0。实时荧光反转录PCR方法的平均变异系数为 7.1%。HepG2细胞hTERTmRNA与hBAmRNA的比值为 (1.3± 0 .3)× 10 -4。结论 :建立了可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。

苏太猪肌内脂肪沉积相关基因SRC-1的差异显示反转录PCR鉴定

采取90头180日龄去势苏太猪的背最长肌组织测定肌内脂肪含量,从中选取肌内脂肪含量差异极显著(P<0.01)的最高和最低各6头组成RNA池,采用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)鉴定两组间差异表达的基因,结果共获得14条表达序列标签(expressed sequence tags),即EST序列,通过GenBank比对发现其中3条为已知序列。为进一步验证这3个已知基因与肌内脂肪之间的关系,从90个个体中选取肌内脂肪最高和最低各15个个体进行实时定量PCR检测。结果表明,细胞核受体共激活因子1基因(SRC-1)mRNA表达水平与肌内脂肪含量存在负相关关系(r=-0.38,P<0.05)。提示:SRC-1蛋白有可能参与了肌内脂肪沉积的调节。

半巢式RT-Realtime PCR方法检测藜草花叶病毒

[目的]根据藜草花叶病毒(SoMV)全基因组中多聚蛋白质基因序列保守区,分别设计2套TaqMAN探针和引物,建立半巢式实时荧光PCR检测SoMV的新方法。[方法]提取病毒核酸进行反转录操作合成cDNA,依据设计好的2套TaqMAN探针和引物,分别进行实时荧光PCR特异性与灵敏度检测,并进行2套引物探针的扩增效率对比试验。[结果]方法特异性强,灵敏度高达0.4 fg/μL植物总RNA,2套引物探针的扩增效率试验对比结果显示扩增效率几乎完全一样。[结论]该方法适用于藜草花叶病毒的检疫鉴定。

18srDNA为内参照的Real-Time-PCR方法检测半夏病毒

利用实时荧光PCR方法,以18srRNA为内参照,对半夏植株及相应组培苗携带的黄瓜花叶病毒(Cu-cumber Mosaic Virus,CMV)含量进行了相对定量检测.并以DAS-ELISA和RT-PCR方法检测结果相比较.结果表明,相比原始植株,组培苗的病毒含量大大降低.以带病毒半夏母株为外植体培养的组培苗,其病毒含量以叶片中的相对较高,在块茎和愈伤组织中病毒相对较低.而ELISA方法在检测病毒含量低的样品时有假阴性结果;RT-PCR方法灵敏度可靠但不适宜精确量化.

直接免疫荧光与实时荧光定量反转录PCR检测常见呼吸道病毒抗原比较

目的观察病毒抗原直接免疫荧光检测(direct fluorescence assay,DFA)和实时荧光定量反转录PCR(real-time reverse-transcription PCR,rt-RT-PCR)检测住院儿童鼻咽分泌物呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)和流感病毒(influenza virus,FLU)的一致性。方法应用DFA、rt-RT-PCR方法检测92例呼吸科住院患儿鼻咽分泌物RSV,应用DFA、rt-RT-PCR方法检测162例呼吸科住院患儿鼻咽分泌物FLU-A和FLU-B,比较2种方法检测的阳性率,Kappa检验分析2种检测方法的一致性。结果 DFA检测RSV的阳性率56.5%低于rt-RT-PCR检测RSV的阳性率70.7%(P<0.05),一致性良好(Kappa=0.517);DFA检测FLU-A、FLU-B的阳性率分别为3.7%和7.4%,rtRT-PCR检测FLU-A、FLU-B的阳性率分别为8.0%和15.4%,2种方法检测FLU-A阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05),一致性较差(Kappa=0.168),检测FLU-B阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05),一致性良好(Kappa=0.489)。结论 rt-RT-PCR检测呼吸道病毒的阳性率明显高于DFA,但2种方法的一致性良好,DFA因设备简单适合用于呼吸道病毒的早期诊断。

一种检测猪基因组中内源性反转录病毒C方法的建立

猪内源性反转录病毒使异种移植猪细胞、组织和器官存在风险,猪内源性反转录病毒A和猪内源性反转录病毒B都出现在猪基因组中,并能在体外感染人。猪内源性反转录病毒C只感染猪细胞,并可整合到大多数猪基因组中,但不是全部。猪内源性反转录病毒A和C的重组能感染人细胞,并大量复制。为了避免这种重组,猪内源性反转录病毒C阳性动物不能用于异种移植。为检测猪内源性反转录病毒C阳性猪,建立了多种不同的方法,如用不同引物建立的特异性PCR技术、异种高灵敏度的巢氏PCR技术和可定量前病毒拷贝数的实时定量PCR技术。实时定量PCR技术可用于区分污染和真正的前病毒分子。这些PCR方法经过优化,具有稳定的检测灵敏性。首先进行PCR1,如果检测结果为阴性,则进行PCR2或PCR5或巢氏PCR;如果检测结果是阳性,则进行实时定量PCR来排除污染。使用这些方法可评估猪内源性反转录病毒C的流行程度和识别未感染猪内源性反转录病毒C的动物。由于可能从其它动物细胞带来污染,不是使用耳活体检测,而是采用血细胞检测。

不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒的动态监测

为明确鸡群经不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的排毒动态,本试验通过设立无特定病原体(SPF)鸡胚6胚龄卵黄囊感染组、1日龄SPF鸡腹腔感染组以及对上述两组SPF鸡分别加入感染鸡的卵黄囊感染同居组和腹腔感染同居组,建立SPF鸡感染REV模型,同时设置空白对照组,在不同日龄记录各组鸡的体重和死亡情况,并综合运用反转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)3种检测方法对各感染组进行REV的动态监测。结果显示:(1)与空白对照组相比,腹腔感染组和卵黄囊感染组SPF鸡体重增长在感染后第21~70天均受到显著抑制(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡的死亡率在感染后第49和63天显著升高(P<0.05),腹腔感染组SPF鸡的死亡率在感染后第42天显著升高(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡血浆中REV病毒载量在感染后第21天显著高于腹腔感染组(P<0.05);(2)卵黄囊感染组SPF鸡自出壳即可检测到病毒血症阳性,并在感染后第21天时达到排毒高峰,腹腔感染组SPF鸡在感染后第14天时达到排毒高峰;(3)卵黄囊感染同居组的10只SPF鸡在感染后第7天时即检测到2只鸡呈病毒血症阳性,腹腔感染同居组SPF鸡在感染后第21天时检测到1只鸡呈阳性;(4)3种检测方法中,RT-qPCR和IFA检出REV效果更好。本试验通过分析不同途径感染REV后鸡群血浆中的带毒状态,为REV感染的科学防控和净化提供参考数据。

经典名方五子衍宗丸干预半去势雄性小鼠生精功能的转录组学分析

目的:筛选五子衍宗丸干预半去势雄性小鼠生精功能相关的转录组,探讨其在干预生精功能低下进展中的潜在作用机制。方法:Balb/c小鼠按体质量随机分为假手术组、模型组、丙酸睾丸素组、五子衍宗丸组,每组12只,模型组和给药组摘取右侧睾丸和附睾构建半去势生精功能低下模型,假手术组仅剪开毛皮和右侧阴囊并立即消毒缝合,饲养1周后,五子衍宗丸组每天灌胃五子衍宗丸混悬液1.56 g·kg^(-1),丙酸睾丸素组肌肉注射丙酸睾丸素0.2 mg·kg^(-1),每周2次,假手术组和模型组每天灌胃等体积生理盐水,连续给药3周。干预结束后,苏木素-伊红(HE)染色观察睾丸组织病理;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清睾酮(T)、促黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)含量;小动物精子自动检测仪测定附睾精子数量和活力;利用转录组学芯片技术检测各组睾丸组织mRNA表达水平,筛选五子衍宗丸调控相关基因转录组,并从中任选3条mRNA进行实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)验证转录组数据。验证合格的转录组数据通过基因本体(GO)注释分析及京都基因和基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析,解析五子衍宗丸调控模型动物生精功能相关的生物条目及信号通路。结果:与假手术组比较,模型组小鼠睾丸组织出现生精损伤,生精小管腔收缩、空泡化、各级生精细胞减少、间隙变宽,生精细胞发育阻滞等形态异常;血清T显著降低,LH显著升高(P<0.01),FSH升高但差异无统计学意义;附睾精子数量、活力均显著降低(P<0.01);睾丸组织中有882条差异表达mRNA,其中565条上调,317条下调,聚类分析表明,这些差异表达的mRNA可以很好地区分假手术组与模型组。与模型组比较,五子衍宗丸组小鼠睾丸组织损伤减轻,生精小管腔结构完整、空泡化减少、各级生精细胞明显增加、排列紧密;血清中T显著升高,LH显著下降(P<0.01),FSH下降但差异无统计学意义;附睾中精子数量和活力显著提高(P<0.01);五子衍宗丸可明显调控半去势小鼠睾丸的159条mRNA,其中32条上调,127条下调,经Real-time PCR验证转录组检测数据可靠。GO和KEGG分析显示,五子衍宗丸调控的转录组功能涉及到睾丸内间质细胞的性激素生成,生精细胞的更新、分化、代谢、凋亡、信号传导等精子发育的整个细胞周期过程,并和生精干细胞功能、内质网蛋白处理及代谢程序等信号通路的生物学行为密切相关。结论:五子衍宗丸可有效改善半去势雄性小鼠造成的生精功能低下,其机制可能与五子衍宗丸干预睾丸转录调节网络,调控睾丸间质细胞性激素合成、生精干细胞功能、精子发生的整个细胞周期过程,以及内质网蛋白处理及代谢程序相关基因转录的表达有关。

豇豆花叶病毒和黑眼豇豆花叶病毒RT-Realtime PCR及IC-RT-Realtime PCR检测方法研究

建立了豇豆两种种传病毒豇豆花叶病毒(CPMV)和黑眼豇豆花叶病毒(BlCMV)RT-Realtime PCR检测方法以及双重RT-Realtime PCR检测方法。在此基础上,根据免疫学抗原抗体特异性吸附的特点,建立了CPMV和BlCMV免疫捕获反转录荧光定量(IC-RT-Realtime)PCR检测方法以及双重IC-RT-Realtime PCR检测方法。该单重及双重IC-RT-Real-time PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和稳定性好等优点,适用于豆类种苗中对CPMV和BlCMV的检测。

一种豇豆重花叶病毒IC-RT real-time PCR检测方法的建立

为建立豇豆重花叶病毒(Cowpeasevere mosaic virus,CPSMV)免疫捕获-反转录-实时荧光(IC-RTreal-time)PCR分子检测方法,利用从ATCC和DSMZ引进的CPSMV标准毒株,先建立CPSMVRTreal-time PCR检测方法;在此基础上,建立用于CPSMV检测的IC-RTreal-time PCR方法.结果表明:IC-RTreal-time PCR方法的灵敏度可达500 pg叶组织;该方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便等优点,省去了RNA的提取过程,适用于豇豆等豆类种子及种苗中对豇豆重花叶病毒的快速检测.

利用外源RNA作为内参结合qPCR准确检测SF2蛋白RIP富集RNA的效率

利用实时荧光定量PCR技术(Real-time Quantitative polymerase chain reaction,q PCR)检测0.1%甲醛交联RNA免疫共沉淀(RNA Immunoprecipitation,RIP)富集SF2蛋白相互作用的RNA效率,为研究可变剪接因子SF2相互作用RNA的富集效率提供准确的质检方案。采用RIP技术获取He La细胞中SF2蛋白相互作用的RNA,等比例加入外源酿酒酵母(BY4741)RNA,并以其β-actin作为内参基因,利用q PCR检测RIP富集SF2蛋白相互作用RNA的效率。结果显示,0.1%甲醛交联RIP技术特异性捕获得到SF2蛋白-RNA复合物;q PCR技术检测阳性基因PABP、Srsf1在SF2抗体捕获的产物和Ig G抗体的产物中相应RNA的浓度差异均在60倍以上。利用q PCR技术,以外源酿酒酵母(BY4741)RNA作为内参,能快速、准确定量检测RNA的富集效率。

HPV mRNA实时荧光定量PCR检测及其与宫颈癌发生的关系

目的建立一种反转录实时荧光定量PCR检测HPV mRNA表达量的方法,研究HPV mRNA表达量与宫颈癌发展的关系。方法取155例宫颈组织标本进行病理学诊断,同时分别进行HPV DNA实时荧光定量PCR检测、HPV E7 mRNA反转录实时荧光定量PCR检测。结果在所有的HPV DNA阳性标本中,宫颈炎和CINⅠ期标本mR-NA表达率为0,CINⅡ期标本mRNA表达率为50%,CINⅢ期标本mRNA表达率为50%,宫颈癌标本mRNA表达率为87.5%;表达水平依次增加。结论 HPV mRNA的表达率及表达量随宫颈癌的发展而增加和增强,其表达水平与宫颈癌发展呈正相关性;HPV mRNA定量检测方法的建立,可以为宫颈癌的预防、发展监测、手术预后等提供重要的临床指导。

实时荧光定量RT-PCR、细胞培养法和鸡胚培养法在流感检测中的对比分析

目的比较本实验室已有的3种流感病毒检测方法的差异,以确定它们在不同情形下的适用方向。方法通过实时荧光定量反转录PCR、细胞培养和鸡胚培养3种方法同时检测488份流感样病例(ILI)鼻咽拭子样本,计算出它们的灵敏度和特异度,并进行统计分析。结果实时荧光定量RT-PCR、细胞培养和鸡胚培养的阳性检测率分别为16.80%、6.76%、3.07%;相对于实时荧光定量RT-PCR,细胞培养的灵敏度为40.24%,特异度为100.00%,鸡胚培养的灵敏度为18.29%,特异度为100.00%;与细胞培养相比,鸡胚培养的灵敏度为45.45%,特异度为100.00%。结论3种方法在灵敏度方面差异很大,但在特异性上没有差异。由于实时荧光定量RT-PCR具有很高的灵敏度,并且检测速度快,适用于暴发疫情的应急检测;细胞培养和鸡胚培养作为经典的病毒分离方法,可以获得流感毒株,用来开展抗原性、基因特性和耐药性等深入研究。

青海家牦牛HIF-1α基因组织特异性表达

[目的]探究青海家牦牛HIF-1α基因组织的特异性表达。[方法]应用半定量反转录PCR和实时定量反转录PCR(SYBRGreen)技术对青海家牦牛HIF-1α基因的组织特异性表达进行检测。通过提取不同组织总RNA,经DNase I消化后,用随机引物进行反转录合成cDNA,采用特异性引物分别对HIF-1α和β-actin基因进行RT-PCR和Real Time RT-PCR扩增。[结果]结果表明,HIF-1α基因在心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、睾丸组织中均有表达,其中以睾丸和脾中HIF-1α基因表达量最高,肌肉的表达量最低。[结论]该研究为进一步揭示HIF-1α在高原土著动物低氧适应过程中的分子机制有着重要的意义。

博尔纳病毒在宁夏的人和动物感染的检测

目的对临床VE患者以及其本人接触动物的检测,探讨BDV在宁夏地区的感染状况及感染机制,并分析BDV核酸和转化后的氨基酸序列,构建病毒种系发生的来源。方法应用巢式逆转录酶聚合酶链反应结合荧光定量PCR检测患者及其接触的动物的外周血单核细胞的p24和p40基因片段。对检测阳性标本进行连接测序,应用MEGA和DnaSP4.0软件对测序结果同国外的标准株HE80、H1766、strainV等进行核酸和氨基酸序列对比分析,并构建病毒基因的系统发生树。结果在60例VE患者及其接触的710绵羊中,PCR检测发现有3例阳性,阳性检出率5%;9头绵羊阳性,阳性检出率为1.27%。基因聚合分析显示人和动物BDV的核酸序列和编码氨基酸序列与德国马源性的HE80株同源性高达100%,重构基因系统发生树可见宁夏VE患者和牛羊BDV核苷酸序列与国外的标准株形成宁夏-德国-日本的混合支系,同时宁夏绵羊BDV序列也形成了一个独立的支系。结论宁夏地区人和牛羊存在BDV的自然感染,并且人的感染存在动物源性,其传染途径很可能是呼吸道的传播可能引起脑炎的非特异性的临床症状,病毒在种系发生中与德国马源性HE80株有极高的同源性,病毒可能由国外引入本土,不排除病毒株变异的可能,人和绵羊之间存在相互传染的可能。