刍议活动性肺结核早期检验中半巢式全自动实时荧光定量PCR检测与涂片抗酸染色法的应用研究

目的评估半巢式全自动实时荧光定量PCR检测与涂片抗酸染色法在活动性肺结核早期检验中的应用效能。方法选取2022年9月—2023年9月于平邑县结核病防治所就诊的90例疑似肺结核患者为研究对象,采用Xpert MTB/RIF技术、涂片抗酸染色法检验及简单法固体培养法同时检测90例疑似肺结核患者痰标本,对检测结果进行比较。结果以固体培养结果作为金标准,痰培养阳性率85.56%,阴性率14.44%。Xpert MTB/RIF阳性率84.44%、阴性率15.56%。涂片抗酸染色法检验阳性率48.88%、阴性率51.11%。Xpert MTB/RIF检验的灵敏度97.40%、准确度96.67%、阳性预测值98.68%以及阴性预测值85.71%均高于涂片抗酸染色法检验50.64%、52.22%、88.64%、17.39%,差异有统计学意义(χ^(2)=43.768、46.722、5.922、22.546,P均<0.05)。结论与涂片抗酸染色法相比,在活动性肺结核早期检验中采用半巢式全自动实时荧光定量PCR检测(Xpert MTB/RIF)的应用效能更高。

半巢式反转录实时荧光PCR检测马铃薯黑环斑病毒

本研究根据基因组中RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)保守序列,设计合成了3条巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针,建立了半巢式反转录实时荧光PCR检测PBRSV的新方法。该方法采用E.Z.N.ATM快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR和TaqMAN探针检测技术。第二步半巢式反转录实时荧光PCR既是对第一步信号的进一步放大,也是对第一步PCR产物的确认,因此,检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Realtime PCR等方法高。实验结果表明,该方法检测灵敏度可达300fg/μL植物总RNA。

巢式实时荧光定量PCR检测RA患者外周血单个核细胞TGF-βRⅡmRNA

目的建立检测人外周血单个核细胞(PBMC)中转化生长因子βⅡ型受体(TGF-βRⅡ)mRNA实时荧光定量PCR方法,并探讨其在RA中的临床意义。方法跨内含子设计外引物,并根据扩增片段,设计一对内引物,采用巢式实时荧光定量PCR(nested-real-time-PCR)方法。首次扩增采用减少引物、酶浓度、及循环次数的方法保持扩增片段的高度特异性,再进行第二次PCR扩增作实时荧光定量检测,同时以β-actin作内参,二者比值作为TGF-βRⅡ表达水平指标。结果Ct值和模板起始浓度对数值之间具有良好的线性关系(r2=0.999);检测最低浓度可达101拷贝。RA患者组和健康对照组的TGF-βRⅡ与β-actin的比值分别为0.45±0.11和0.37±0.10,两者有显著差异(P<0.01);RA治疗前、后两者比值分别为0.46±0.11和0.40±0.11,治疗后下降13.0%。结论巢式实时灾光定量PCR检测PBMC中TGF-βRⅡmRNA的方法简便,特异,重复性好,可信度高,其表达水平对RA具有一定的诊断价值,并可作为评价该病治疗效果的一种方法。

凡纳滨对虾卵黄蛋白原和血蓝蛋白mRNA在卵巢不同发育时期的半定量和实时荧光定量PCR分析

卵黄蛋白原和血蓝蛋白是凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)卵巢和/或肝胰腺合成的重要蛋白。利用半定量和荧光定量PCR技术分别检测了亲虾卵巢不同发育期卵黄蛋白原和血蓝蛋白mRNA在卵巢和肝胰腺的相对表达量。结果显示,卵黄蛋白原mRNA在卵巢和肝胰腺中均有表达,其相对表达量随着卵巢发育持续增加,在第五期达到最高,在恢复期迅速下降。根据卵巢和肝胰腺质量的综合计算,凡纳滨对虾的卵黄蛋白中,卵巢的贡献率占主导地位,约占80%,而肝胰腺仅为卵巢的四分之一。血蓝蛋白mRNA主要在肝胰腺中表达,随着卵巢的发育,表达量呈增加趋势,至第三期达到高峰,其后稍有下降,但仍然维持在较高水平,在第六期恢复到初始水平。血蓝蛋白是否直接或间接参与了卵黄发生和卵巢发育有待进一步探讨研究。

半巢式RT-Realtime PCR方法检测藜草花叶病毒

[目的]根据藜草花叶病毒(SoMV)全基因组中多聚蛋白质基因序列保守区,分别设计2套TaqMAN探针和引物,建立半巢式实时荧光PCR检测SoMV的新方法。[方法]提取病毒核酸进行反转录操作合成cDNA,依据设计好的2套TaqMAN探针和引物,分别进行实时荧光PCR特异性与灵敏度检测,并进行2套引物探针的扩增效率对比试验。[结果]方法特异性强,灵敏度高达0.4 fg/μL植物总RNA,2套引物探针的扩增效率试验对比结果显示扩增效率几乎完全一样。[结论]该方法适用于藜草花叶病毒的检疫鉴定。

代谢综合征相关新基因MSRG实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立测定MSRG mRNA表达量的实时荧光定量PCR检测方法,为新基因的功能研究奠定基础。方法根据MSRGcDNA序列设计荧光PCR适用的引物和探针,构建质粒标准品,建立标准曲线用于荧光PCR相对定量,检测荧光PCR方法的灵敏性、特异性和重复性。荧光PCR检测不同浓度葡萄糖[5.6mmol/L(G5.6)、22mmol/L(G22)、33.3mmol/L(G33.3)]刺激人肝癌细胞株HepG2细胞MSRG的表达并与半定量RT-PCR方法进行比较。结果建立了MSRG mRNA表达的实时荧光PCR检测方法。荧光PCR检测显示G33.3、G22和G5.6组HepG2细胞MSRG表达均有显著差异,半定量RT-PCR方法检测G33.3组MSRG表达显著增加,但不能检测出G22和G5.6组间有差异。结论本实验建立的MSRG mRNA表达实时荧光PCR检测方法灵敏性、特异性和重复性较好,为MSRG功能的研究提供了一种重要手段。

疟疾的实时荧光PCR快速检测方法探讨

目的探讨疟疾的实时荧光PCR快速检测方法。方法选择本市国际旅行卫生保健中心提供的疟疾镜检阳性血样20份,另选择健康者(疟疾镜检阴性)血样20份作为待测血样。本研究设计了疟疾病原体实时荧光PCR快速检测的引物和探针,总结了快速检测方法,疟疾镜检阳性/阴性血样均各分为4次检测完毕,统计各份血样检测结果和每次检测时间,计算平均用时和疟疾镜检与实时荧光PCR检测符合率。结果疟疾镜检阳性血样20份,检测4次,平均用时(19.15±1.34)min,疟疾镜检阴性血样平均用时为(19.52±1.49)min,40份血样荧光PCR检测平均用时(19.34±1.65)min。在荧光PCR检测与疟疾镜检符合率方面,阳性血样(100%)和阴性血样(90.00%)比较,无显著差异P>0.05,认为无统计学意义。40份待测血样荧光PCR检测和疟疾镜检符合率为95.00%(38/40)。结论本研究疟疾病原体实时荧光PCR快速检测准确性高,阳性检出高,检测时间段,用于疟疾快速检验可行性较强,不易发生漏检情况。

18srDNA为内参照的Real-Time-PCR方法检测半夏病毒

利用实时荧光PCR方法,以18srRNA为内参照,对半夏植株及相应组培苗携带的黄瓜花叶病毒(Cu-cumber Mosaic Virus,CMV)含量进行了相对定量检测.并以DAS-ELISA和RT-PCR方法检测结果相比较.结果表明,相比原始植株,组培苗的病毒含量大大降低.以带病毒半夏母株为外植体培养的组培苗,其病毒含量以叶片中的相对较高,在块茎和愈伤组织中病毒相对较低.而ELISA方法在检测病毒含量低的样品时有假阴性结果;RT-PCR方法灵敏度可靠但不适宜精确量化.

多重巢式和定量PCR联合应用提高SARS病毒检测率

目的寻求一种可靠、可行的对急性严重呼吸道综合征病毒的早期诊断方法。方法应用多重巢式PCR联合荧光实时定量方法,对广州地区91份确诊和疑似病例标本、25份健康志愿者标本同时进行检测。结果25份健康志愿者标本经两种方法检测均为阴性。91份确诊和疑似病例标本经多重巢式PCR方法检测,阳性标本数53例,总阳性检测率58.24%;荧光实时定量PCR检测阳性标本数68例,阳性检出率74.73%;两种方法联合,阳性标本数76例,阳性检出率83.52%。结论多重巢式PCR联合荧光实时定量方法可进一步提高SARS病毒的阳性检出率,也为今后应对可能发生的其它突发性传染病病毒的检测提供分子诊断基础。

三种PCR方法检测柑橘黄龙病菌的效果比较

为了比较常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR方法在大田检测中对柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)的检测效果,首先比较了3种检测方法对柑橘黄龙病菌检测的灵敏度,结果发现:3种检测方法的灵敏度依次为常规PCR<巢式PCR<实时荧光定量PCR。运用3种检测方法对广东5个柑橘品种上的189个黄龙病疑似病样进行检测,结果发现:黄龙病检出率依次为常规PCR<巢式PCR<实时荧光定量PCR。研究表明:常规PCR适合以较低成本大规模检测黄龙病;实时荧光定量PCR具有最大的检测灵敏度;巢式PCR检测技术同时具有前两者的一些优点,但操作较复杂,适合技术熟练的研究者使用。

黑色素基因在半番鸭及番鸭不同羽色中的差异表达研究

黑色素对动物毛(羽)色的形成具有重要作用。为探寻半番鸭和番鸭MC1R和TYR基因表达对其羽色的遗传效应,采用实时荧光定量PCR技术分析MC1R和TYR基因在半番鸭和番鸭不同羽色皮肤组织中的表达情况。结果显示:MC1R和TYR基因在半番鸭和番鸭黑羽皮肤中的mRNA表达量均极显著高于白羽皮肤(P<0.01),MC1R基因在半番鸭和番鸭黑羽皮肤中的表达量分别为白羽皮肤的9.08倍和3.13倍,TYR基因在半番鸭和番鸭黑羽皮肤中的表达量分别为白羽皮肤的2.50和14.54倍。由此说明,TYR和MC1R基因表达水平与羽色形成有一定的关系。

苦瓜果实β-半乳糖苷酶基因的克隆、表达及亚细胞定位

根据已构建苦瓜果实均一化文库中获得的1个与β-Gal基因相关的EST序列,采用经3'RACE技术,克隆获得1个苦瓜β-Gal基因的cDNA序列McGAL,全长为2261 bp,开放阅读框2160 bp,编码719个氨基酸。该基因在GenBank基因数据库的登录号为AFD54987.1。应用生物信息学软件对McGAL氨基酸序列分析表明,McGAL含有糖苷水解酶家族35的保守结构域G-G-P-[LIVM]-x-Q-x-E-N-E-[FY],C端不含凝集素结构域。二级结构显示,该酶含有α-螺旋(19.89%)、伸展链(26.98%)、β-转角(6.54%)和无规卷曲(46.59%)。McGAL氨基酸序列与鹰嘴豆、苜蓿、绿豆、大豆、羽扇豆的氨基酸序列的同源性分别达到73%、73%、73%、72%和71%。亚细胞定位结果表明,McGAL定位在线粒体膜上。荧光定量结果表明,McGAL在果实绿熟期表达量最高并随之下降,该基因可能与果实成熟软化初期相关。

枣果实β-半乳糖苷酶基因的克隆及表达分析

采用3-′RACE技术获得了梨枣果实β-半乳糖苷酶(-βGal)基因的部分cDNA片段,并运用实时荧光定量PCR技术和PNPG反应比色法,研究了梨枣不同生长期及采后常温贮藏过程中ZJGAL基因的相对表达量和β-Gal活性的变化,以探索β-半乳糖苷酶在枣(Ziziphus jujubaMill.)果实生长及采后软化中的分子调控机制.结果表明,克隆的-βGal基因序列长2 584 bp(GenBank登录号HQ827769),其中包含2 193 bp的最大阅读框,编码730个氨基酸,将该基因命名为ZJGAL.Blastn和Blastp序列比对分析发现,该ZJGAL基因与已登录的其他物种的β-Gal基因相似性达到60%～80%.随着果实的生长、成熟及采后衰老,ZJGAL基因的表达量和-βGal活性在果实采收前后均呈先上升后下降的趋势,两者的采前高峰均在幼果膨大期,但是采后贮藏过程中虽然基因的表达量较高,但是-βGal活性一直较低.

半滑舌鳎Dmrt3基因cDNA片段的克隆与表达分析

同源克隆了半滑舌鳎Dmrt3基因的部分cDNA片段,片段长度为228bp,NJ系统发育树显示,半滑舌鳎Dmrt3基因cDNA片段与红鳍东方鲀、青鳉以及斑马鱼的Dmrt3基因cDNA片段同源性最高,首先聚为一支。实时定量分析了Dmrt3基因在半滑舌鳎雌性和雄性个体的各组织中的表达情况,以及在高温处理和甲基睾酮处理组的雌性、雄性和伪雄鱼的性腺组织中的表达。Dmrt3基因在雌性和雄性的脑、垂体、性腺、肝脏、脾脏、心脏、肾脏7个组织中都有表达,但是表达量有差异,在精巢中的相对表达量高,Dmrt3基因在精巢的表达与其它组织中的表达差异极显著(P<0.01),而在卵巢中的表达很微弱,结果预示Dmrt3基因可能在雄性的性腺发育过程中起着重要的作用。高温处理组的雌性、雄性和伪雄鱼的性腺组织之间Dmrt3的表达无显著差异(P>0.05),但都极显著低于对照组的雄鱼(P<0.01)。高温处理组的伪雄鱼与对照组雌鱼性腺中Dmrt3的表达表达无显著差异(P>0.05)。甲基睾酮处理组的雄鱼和伪雄鱼性腺中Dmrt3的表达都显著高于对照组雄性(P<0.01)。从孵化后43d到5月龄,Dmrt3的相对表达量很低,7月龄时表达量显著升高,9月龄时达到最高峰,12月龄时表达量下降,这也预示Dmrt3基因在半滑舌鳎性腺的发育过程中起重要作用,可能是促进生殖细胞发育的重要转录因子。

半滑舌鳎StAR基因克隆及其在不同组织的时空表达分析

利用半滑舌鳎性腺转录组测序获得的StAR基因部分序列,设计RACE引物,克隆了半滑舌鳎StAR基因的cDNA序列,全长为1 294 bp,5'端UTR为132 bp,3'端UTR为310 bp,开放阅读框(ORF)为852 bp,共编码283个氨基酸。将半滑舌鳎StAR基因与其他物种StAR基因进行氨基酸同源性分析,结果显示,半滑舌鳎StAR与塞内加尔鳎、大口黑鲈、花鲈、金头鲷的同源性都达到了85%,与虹鳟、斜带石斑鱼及日本鳗鲡的同源性分别为81%、83%和76%。雌、雄鱼不同组织StAR基因的表达分析表明,StAR基因在雄鱼性腺中高表达,在雄鱼的肝脏、脑及心脏中表达量较低,而在雄鱼的其他组织中不表达;在雌鱼肠中不表达,在其他组织(卵巢、肝脏、脾脏、脑、垂体、肌肉、心脏、肾脏)中微量表达。荧光定量PCR分析不同组织与不同时期性腺表达谱表明,雄鱼性腺中StAR基因的表达量显著高于雌、雄鱼其他各组织(P<0.05),提示StAR基因对雄鱼精巢发育起重要作用。雄鱼不同时期表达谱分析结果显示,StAR基因在66天前的精巢中不表达,在150天时表达量急剧增加,至2龄时表达量最高,3龄时表达量下降,说明该基因在精巢发育成熟过程中起重要作用。原位杂交结果显示,StAR基因主要在雄鱼精巢的精子细胞中表达,而在雌鱼的卵巢中不表达。研究表明,StAR基因在半滑舌鳎精巢发育中发挥作用,且可能在精子形成中发挥重要作用。

半滑舌鳎促黄体激素基因克隆和表达分析及其血清浓度测定

利用RACE技术首次克隆了半滑舌鳎脑垂体中促黄体激素(LH)基因cDNA全长序列。该基因全长670 bp,开放阅读框为477 bp,编码158个氨基酸。与其他脊椎动物的LH成熟肽氨基酸序列同源性比较表明:半滑舌鳎LH与鲽形目和鲈形目同源性高58%～68%。另外,半滑舌鳎LH含有12个保守的半胱氨酸残基和1个N-糖基化位点(19～21 NQT)。实时荧光定量组织表达分析表明,LH mRNA在脑、垂体、卵巢等组织中表达,垂体中表达量最丰富,其他组织尤以脑、性腺表达量较高,推测半滑舌鳎LH可能具有广泛的垂体外生理功能;实时荧光定量PCR方法对繁殖周期雌性半滑舌鳎LH表达水平进行测定,结果表明,LH mRNA在Ⅱ～Ⅵ各繁殖周期的脑、垂体、卵巢3种组织都有表达,但表达水平有差异,在Ⅳ、V期表达量最丰富,说明LH主要促进卵母细胞最终成熟及排卵。利用125I标记的放射免疫测定(RIA)技术检测繁殖周期半滑舌鳎血清LH浓度,结果表明LH在V期含量最丰富,也说明LH主要促进卵母细胞最终成熟及排卵。

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)半乳糖凝集素PtGAL的基因克隆与原核重组表达

半乳糖凝集素(Galectin)是动物凝集素家族的一员,在脊椎动物和无脊椎动物中都参与了重要的免疫防御反应,是一种重要的免疫因子。通过RT-PCR和RACE技术克隆获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)半乳糖凝集素基因全长,并命名为PtGal。该基因全长875bp,开放阅读框为669bp,编码222个氨基酸,包含一个糖识别结构域CRD(位于16—142位氨基酸),预测蛋白的分子量(Mw)为23529.4Da,理论等电点(p I)为5.21。同源性比对结果显示,PtGal编码的氨基酸序列与中华绒螯蟹、南美白对虾、日本囊对虾galectin的同源性分别为77%、66%、58%。实时荧光定量PCR(qRT-RCR)结果表明,PtGal在三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、肠、胃、鳃、心脏、性腺中都有表达,其中在性腺中的表达量最高,在肝胰腺中的表达量最低,但人工感染溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)后,肝胰腺的表达呈先升高后降低的趋势。利用原核表达系统对三疣梭子蟹PtGal进行了重组表达,并通过纯化复性获得了重组目的蛋白rPtGal,ELISA检测rPtGal与不同细菌及真菌的结合活性,结果表明,该重组蛋白与革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌均有较强的结合。本研究为进一步深入研究三疣梭子蟹半乳糖凝集素的功能奠定了基础。

半滑舌鳎miR-200a和miR-200b前体克隆及其免疫应答分析

为了探究半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)miR-200a和miR-200b在免疫应答中的作用,采用PCR方法克隆了半滑舌鳎miR-200家族的miR-200a和miR-200b的前体序列,长度分别为82和88 bp;用The mfold Web Server和Clustalx1.83软件对其前体序列进行了二级结构和同源性分析,miR-200a和miR-200b都具有典型的颈环结构,与其他物种具有较高的同源性。qRT-PCR分析结果显示,miR-200a和miR-200b在健康半滑舌鳎13种组织(肝脏、肠、脾脏、头肾、后肾、鳃、血液、脑、皮肤、肌肉、胃、心脏和卵巢)中均有表达,miR-200a在头肾中表达量最高,在血液中表达量最低,miR-200b在肝脏中表达量最高,在肌肉中表达量最低;miR-200a和miR-200b在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染半滑舌鳎后不同时间点的4种免疫相关组织(肝脏、肠、脾脏和头肾)中的表达呈现出先上调后下降的规律,但表达达到峰值的时间点有所不同。miR-200a在肝脏和脾中的表达峰值出现在鳗弧菌感染后6h,在肠和头肾中则是鳗弧菌感染后12h,miR-200b在肠、脾和头肾中均在鳗弧菌感染后12h达到表达高峰;miR-200a和miR-200b在脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、葡聚糖(WGP)、聚肌胞苷酸(poly I:C)4种病原模拟物刺激后的半滑舌鳎肝脏细胞系中呈现出上调表达趋势,其中Poly I:C刺激半滑舌鳎肝脏细胞系后miR-200a上调表达趋势明显,6h的表达量为0h的9倍,在WGP刺激半滑舌鳎肝脏细胞后miR-200b上调表达趋势明显,2h的表达量为0的9倍。研究结果为揭示miRNA在半滑舌鳎免疫应答中的作用提供了科学依据。

半滑舌鳎促滤泡激素基因全长cDNA的克隆与组织表达分析

从半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis Günther脑垂体中提取总RNA，利用RT-PCR和RACE技术首次克隆得到半滑舌鳎促滤泡激素（FSH）基因全长cDNA序列。半滑舌鳎FSHcDNA全长为541bp，开放阅读框为393bp，编码130个氨基酸（GenBank序列登录号：JQ277933）。发现一个N-糖基化位点：24～27NTT。与其他脊椎动物的FSH成熟肽氨基酸序列同源性比较表明，半滑舌鳎FSH与鲽形目和鲈形目鱼类FSH同源性为42％～49％，与鲤形目和高等脊椎动物FSH同源性为27％～319/5。用MEGA4．0软件构建了NJ树，获得的进化树表明，半滑舌鳎FSH与其他鱼类FSH聚类，亲缘关系较近。实时荧光定量组织表达分析表明，FSHmRNA除在垂体中大量表达外，其他组织也有表达，尤以脑、性腺表达量较高。半滑舌鳎FSHmRNA在垂体以外组织中的广泛表达，暗示FSH可能具有广泛的生理功能。

N-乙酰半胱氨酸改善高游离脂肪酸所致大鼠外周胰岛素抵抗

目的探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)对高游离脂肪酸(FFA)导致的外周胰岛素抵抗的影响及机制。方法SD大鼠随机分为对照组(NS组,12只)、脂肪乳输注组(FFA组,13只)和脂肪乳+NAC组(NAC组,12只)。输注48 h,(1)测血浆硝基酪氨酸,丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)水平;(2)高胰岛素正糖钳夹试验,评价外周胰岛素抵抗程度;(3)实时荧光定量PCR方法测定肌肉组织胰岛素受体底物-1(IRS-1)、胰岛素受体底物-2(IRS-2)mRNA表达。结果(1)FFA组硝基酪氨酸,MDA高于NS组,GSH低于NS组,NAC分别改善28.6%,33.1%,22.9%(P<0.05);(2)FFA组葡萄糖输注率(GIR)比NS组降低(P<0.05),用NAC后GIR升高36.6%(P<0.05);(3)FFA组肌肉组织IRS-1、IRS-2 mRNA表达比NS组降低87.7%、50.7%(P<0.05);NAC组肌肉组织IRS-1、IRS-2表达比FFA组增加370.1%、46.2%,(P<0.05)。结论NAC干预能改善高FFA所致的外周胰岛素信号传导障碍,逆转外周胰岛素抵抗,可能与NAC纠正机体氧化及抗氧化失衡有关。