快速检测细菌并革兰分型的半巢式聚合酶链反应及其初步应用

目的以半巢式聚合酶链反应(PCR)检测细菌及作革兰阴、阳性分型,并与细菌培养法比较。方法以细菌16SrRNA基因为靶序列,采用一对通用引物(pm1,pm3)和一条革兰阴性型特异性引物(pm2),以半巢式PCR方法扩增实验室保留菌株的DNA并作出革兰染色分型;以人类外周血白细胞基因组DNA、HBVDNA阳性血清以及白假丝酵母菌为对照,检测此方法的特异性;采用倍比稀释菌液作敏感性实验;与细菌培养法比较,验证此方法检测临床标本的敏感性。结果对17个实验室保留菌株进行检测,以通用引物对作第1次PCR均得到371bp长度的DNA片段;再以革兰阴性菌特异引物对(pm2,pm3)作第2次PCR,9种阴性菌均得到353bp的DNA片段,而8种阳性菌未被扩增。特异性实验表明,此通用引物与人类基因组DNA、真菌及病毒无交叉反应。敏感性实验表明,采用半巢式PCR可检测出3个CFU的细菌。对120份临床标本检测,半巢式PCR检测阳性率(29.2%)显著高于细菌培养法检测阳性率(17.5%)。结论此半巢式PCR检测细菌方法,具有特异、敏感、快速的特点,并能对细菌进行革兰阴性、阳性分型,可用于临床感染性疾病的初步诊断。

荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应检测大鼠死后肾mRNA

目的探讨荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应(fluorescencesemi-quantitativereversetranscrip-tase-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测大鼠死后不同时间肾3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA含量变化对死亡时间(postmorteminterval,PMI)推断的应用价值。方法28只大鼠断颈处死后置于20℃温控系统内,利用荧光标记半定量RT-PCR技术检测大鼠肾GAPDHmRNA在死后48h内相对表达量的变化情况。结果在死后即刻至40h内大鼠肾均可检测出GAPDHmRNA,且其扩增产物呈规律性下降。结论荧光半定量RT-PCR技术检测大鼠死后肾GAPDHmRNA含量变化对PMI推断具有一定的应用价值。

多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应快速检出含漱液中的乙型流感病毒

目的建立特异敏感的快速检测含漱液中的流感病毒的分子生物学方法。方法用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲１、甲３和乙型流感病毒ＨＡ基因的ＨＡ１片段，得到各病毒与特异性大小的扩增产物的对应关系。用同样的方法扩增含漱液中流感病毒的ＨＡ基因的ＨＡ１片段。根据这对应关系检测含漱液中的流感病毒。结果以流感病毒的ＨＡ基因为模板设计的三对引物，用多重逆转录聚合酶链反应能特异性地扩增出９４２ｂｐ、１１１７ｂｐ和 ７５１ｂｐ的核酸片段，它们分别和甲１、甲３和乙型流感病毒有稳定对应关系。用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增含漱液中流感病毒ＨＡ基因的ＨＡ１片段，根据扩增产物的大小检出含漱液中的乙型流感病毒。结论 多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应能特异敏感地检出含漱液中的乙型流感病毒。

反转录巢式多重聚合酶链式反应体系检测单细胞中时钟基因表达

目的建立一种高度灵敏的能够在单细胞水平检测时钟基因表达的反转录巢式多重聚合酶链式反应(multiplex nestedreverse transcription-polymerase chain reaction,multiplex nested RT-PCR)体系。方法选取核心时钟基因bmal1,clock,per1,per2,cry1和cry2,以及看家基因β-actin,分别设计和优化巢式引物对。以基因质粒为模板,检测巢式多重PCR体系的灵敏度。体外转录得到各个基因的RNA模板,并检测反转录巢式多重PCR体系的灵敏度。使用手动微操作器,显微镜下负压获取悬浮单个NIH/3T3细胞,使用反转录巢式多重PCR体系检测其中目的时钟基因。应用实时定量PCR检测整体水平时钟基因表达情况,与单细胞水平进行比较。结果巢式多重PCR检测体系可以检测出单拷贝质粒DNA。反转录巢式多重PCR能够检测出4拷贝RNA模板。利用上述体系发现,NIH/3T3单细胞中时钟基因环路表达存在很大差异,同时发现群体水平per1和per2表达的高峰和低谷间差异有统计学意义,而单细胞水平per1表达则差异无统计学意义。结论建立了高度灵敏的用于检测时钟基因表达的反转录巢式多重PCR体系,揭示了单细胞水平时钟基因表达的异质性,也验证了整体水平与单细胞水平时钟基因表达的差异。

正交设计优化半夏相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应体系

目的采用正交设计优化半夏SRAP-PCR的反应体系。方法以半夏基因组DNA为模板,应用L_(16)(4~5)正交表,研究了Taq酶、Mg^(2+)、随机引物、dNTPs和模板DNA 5种SRAP反应组分浓度变化对扩增结果的影响。结果优化反应体系为:25μL反应体系中含有buffer2.5μL、Taq酶1.0U、Mg^(2+)2.5mmol/L、引物0.8μmol/L、dNTPs0.1 mmol/L、模板DNA 50 ng。结论正交设计能客观高效的优化半夏SRAP反应体系。

半巢式聚合酶链反应在浆膜腔细菌感染诊断中的初步应用

目的观察革兰分型半巢式聚合酶链反应(PCR)在浆膜腔细菌感染诊断中的应用价值。方法对30例浆膜腔积液标本,以细菌16SrRNA基因为靶序列,采用一对通用引物和一条革兰阴性菌特异性引物,以半巢式PCR方法进行检测,并同时作细菌培养。结果以通用引物对30例标本作第1次PCR,11例扩增出371bp长度的DNA片段,阳性率为36.7%;对阳性PCR产物再以革兰阴性菌特异性引物作第2次PCR,9例扩增出353bp的DNA片段即为革兰阴性菌。对此30例标本作细菌培养,阳性率为16.7%,低于PCR扩增法。5例标本细菌分离结果与半巢式PCR革兰分型结果相同。结论革兰分型半巢式PCR方法能够灵敏地检测细菌并作出革兰阴性、阳性分型,对于浆膜腔感染的早期诊断具有较好的应用价值。

半巢式聚合酶链反应一次加样法检测血液HBV DNA

目的 消除巢式聚合酶链反应 (nestedPCR)检测乙型肝炎病毒 (HBV)实验中 2次加样带来交叉污染的机会 ,提高PCR特异性和敏感性。方法 通过设计内部、外部引物的不同长度和不同反应浓度 ,改变退火温度 ,建立半巢式PCR一次加样法检测HBVDNA。 3个PCR引物同时加入反应管进行 2次PCR反应 ,在一个反应管内完成巢式PCR。结果 该法可检出 4个分子的目的基因片段。在 16例ELISA和常规PCR检测HBV阴性的血清标本中 ,半巢式PCR一次加样法检出 2例阳性。结论 该方法简便、敏感、特异。与ELISA同时应用 ,可提高临床标本HBV阳性检出率 ,减少假阴性 。

多重半巢式聚合酶链反应检测巨细胞病毒DNA多聚酶基因

目的 :探讨多重半巢式聚合酶链反应 ( msn PCR)在研究巨细胞病毒 ( CMV) DNA多聚酶基因 ( UL -54)中的应用价值。方法 :从 8例心肺移植患者血标本中提取 DNA,以 CMV-UL 54为模板 ,自行设计 6条特异性引物 ,建立 msn PCR扩增系统。扩增产物在 DNA测序仪上自动测序。结果 :msn PCR能扩增出 42 7bp和 1 0 52 bp两条目的片段 ,扩增产物测序表明存在导致氨基酸改变的碱基有义突变。结论 :msn PCR扩增结合测序 ,可检测 CMV-UL 54的 7个功能区目片段中的碱基突变 ,msn PCR比普通 PCR更加省时和经济。

半巢式聚合酶链反应-微孔板杂交法检测沙眼衣原体

目的 应用半巢式聚合酶链反应 -微孔板杂交法 (半巢式PCR -MPH)检测泌尿生殖道沙眼衣原体 (Ct)。方法 分别用质粒和主要外膜蛋白基因引物进行扩增。将下游引物用生物素标记 ,经半巢式PCR扩增Ct主要外膜蛋白基因后 ,扩增产物被包被有链霉亲和素的微孔板捕获 ,经碱变性后与标有荧光素的特异性探针进行杂交。然后通过辣根酶标记的抗荧光素抗体与杂交分子反应 ,经过酶底物显色 ,通过测定吸光度来判断结果。结果 主要外膜蛋白基因引物半巢式PCR较质粒引物PCR更敏感 ,比半巢式PCR产物酶切后电泳法高 1 0倍 ,半巢式PCR -MPH法特异性强。该法重复法好 ,批内CV值 <1 0 % ,批间CV值 <1 5 % ;该法在包被浓度为 4mg L、产物 1∶2 0稀释、与微孔板结合 2 0min后加入 1 0pmol mL探针杂交 3 0min ,用 1∶3 0 0 0稀释的酶显色条件下有最佳结果。结论 该法操作简便、敏感性和特异性均高 ,无放射性和EB染料污染 ,适于临床样本的常规检测。

用两种聚合酶链反应方法检测流感病毒

目的 建立特异敏感的快速检测流感病毒的分子生物学方法。方法 用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3 和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果 以流感病毒的HA基因为模板设计的 3对引物能特异性地扩增出 94 2bp、1117bp和 75 1bp的核酸片段 ,它们分别和甲1,甲3 和乙型流感病毒有稳定对应关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为0 1TCID50 的样品。结论 多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法。

猪圆环病毒3型半巢式PCR方法的建立和应用

为建立快速检测猪圆环病毒3型(PCV-3)的方法,以Gen Bank上登陆的我国PCV-3全基因组为参考毒株,设计3条引物,建立了PCV-3半巢式PCR诊断方法。本方法可以扩增出大小为249 bp的特异性条带,与预期大小一致,而猪圆环病毒1型和2型、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒等对照样品均未扩增出特异性条带。将PCV-3的阳性DNA稀释后作为模板,发现半巢式PCR的检测极限可以达到5×10^(-3)μg/m L。对临床80份样品进行检测,发现半巢式PCR的阳性检出率可以达到27.5%(22/80),而常规PCR的检出率仅为6.25%(5/80)。检测结果表明,本文建立的半巢式PCR方法较为准确、特异和敏感,适用于PCV-3的快速检测和流行病学调查。

猪附红细胞体半巢式PCR诊断方法的建立

目的为能够更加准确、敏感的检测出猪附红细胞体(Mycoplasma suis,M.suis),本试验建立一种新的诊断方法—半巢式聚合酶链反应(hemi-nested Polymerase Chain Reaction,hemi-nested PCR)。方法利用Oligo 6.0和Primer 5.0软件设计筛选出合适的PCR引物,经酶切分析和半巢式PCR进一步鉴定后进行序列测定。同时与普通PCR诊断方法进行比较。结果测得的猪附红细胞体基因序列与GenBank中发表的猪附红细胞体基因序列(AJ504999)同源性为100%。特异性试验结果表明本实验设计的PCR引物不能从弓形虫、链球菌、大肠杆菌、猪肺炎支原体和猪伪狂犬病病毒的基因组DNA中扩增出条带。通过敏感性试验,半巢式PCR诊断方法最低能够检测出0.12fg的标准模板DNA。通过与普通PCR比较,证明本试验建立的半巢式PCR更具敏感性和实用性。结论本试验建立的半巢式PCR诊断方法具有特异、敏感、实用等特点,为猪附红细胞体的检测提供了一种可靠的诊断方法。

检测AML多药耐药基因mRNA表达的多重半巢式逆转录PCR方法的建立

目的建立多重逆转录和半巢式PCR的方法检测急性髓性白血病(AML)多药耐药(MDR)基因mRNA表达。方法分别设计针对5种MDR基因和1种内参照基因的特异性引物,采用多重逆转录和半巢式PCR检测耐药细胞株HL60/VCR和难治性AML患者骨髓标本中的MDR基因mRNA表达。结果应用此多重逆转录和半巢式PCR反应系统,可以特异的在一个反应管内同时检测到5种耐药基因。结论该方法对于检测AML患者MDR基因mRNA表达具有快速、灵敏、简便等特点,能快速同时分析大量样本,对MDR研究、诊断和治疗有一定应用前景。

用半巢式PCR检测无创性标本诊断卡氏肺孢子虫肺炎的实验研究

目的无创性诊断卡氏肺施子虫肺炎。方法采用一对半引物进行半巢式DHFR－PCR检测实验大鼠无创性标本——支气管液、血清及活检标本——肺及肝脏组织中的卡氏肺孢子虫DNA。结果从59只经病理学检查证实的卡氏肺孢子虫肺炎大鼠中采集到的上述4种标本，卡氏肺孢子虫DNA的半巢式DHFR－PCR检出率分别为72.7％（32／44），37.3％（22／59），94．9％（56／59）和36．4％（8／22），而DHFR－PCR的检出率则仅为25％，13．6％，71．2％和9．1％。12只轻度感染的PCP大鼠的无创性标本中卡氏肺孢子虫DNA的检出率由刚提高至41．7％。正常鼠标本及各种病原体对照的半巢式DHFR－PCR均为阴性。结论用半巢式DHFR－PCR无创性地诊断大鼠卡氏肺孢子虫肺炎具有敏感、特异、省时、省力等优点；本文在血和肝中检出卡氏肺孢子虫DNA，提示在卡氏肺孢子虫肺炎大鼠模型中存在虫血症和肺外卡氏肺孢子虫感染。

IgA肾病患者β1,3-半乳糖基转移酶特异性伴侣蛋白Cosmc基因编码区的序列分析(英文)

背景:IgA肾病发病机制迄今不明,目前研究证实IgA肾病患者IgA1分子铰链区β1,3-半乳糖基转移酶的活性降低引起IgA1分子O-糖基化异常是该病发生的重要途径。作者前期研究推测IgA肾病患者外周血B淋巴细胞β1,3-半乳糖基转移酶特性伴侣蛋白Cosmc表达降低可能是IgA肾病糖基化异常原因的中心环节。目的:检测IgA肾病患者β1,3-半乳糖基转移酶特异性伴侣蛋白Cosmc基因编码区的DNA序列,并与Gene Bank公布的序列比对。设计:病例-对照观察。单位:四川大学华西医院肾内科。对象:选择2005-11/2006-08四川大学华西医院肾内科收治的肾病患者37例,包括IgA肾病患者27例和非IgA肾病患者10例,另选择5例健康自愿者,所有观察对象均知情同意。方法:实验于四川大学生物治疗国家重点实验室完成。采集所有观察对象的肝素钠抗凝外周静脉血2mL,采用经典酚氯仿法提取外周血基因组DNA,应用紫外分光光度仪定量DNA的含量,应用聚合酶链反应扩增所有观察对象的β1,3-半乳糖基转移酶特异性伴侣蛋白Cosmc基因编码区,并对每个观察对象的聚合酶链反应产物进行直接测序,将所有测序结果分别与GeneBank公布序列一一进行比对。主要观察指标:β1,3-半乳糖基转移酶特异性伴侣蛋白Cosmc基因编码区的聚合酶链式反应产物扩增结果及测序序列。结果:①Cosmc基因的编码区位于Cosmc基因的257-1213位,扩增后的Cosmc基因大小为1247bp。②IgA肾病患者、非IgA肾病患者以及健康自愿者之间的β1,3-半乳糖基转移酶特异性伴侣蛋白Cosmc基因编码区序列均一致,并与GeneBank公布的序列无差异。结论:未发现IgA肾病患者有Cosmc基因编码区序列异常,提示Cosmc基因编码区序列与IgA肾病IgA1分子的糖基化异常可能无关。

半巢式PCR方法检测外套细胞淋巴瘤bcl-1/IgH基因重排

目的 探讨敏感、特异而又快捷的bcl_1/IgH基因重排检测方法。方法 对28例经临床确诊的外套细胞淋巴瘤的新鲜冰冻组织 ,分别采用半巢式PCR和一步法PCR检测bcl_1/IgH基因重排。结果 通过半巢式PCR测得有bcl_IgH基因重排者计17/28例 ,而采用一步法PCR仅9例有此基因重排 ,两者检出率差异有显著性意义 (χ2=4.59,P<0.05)。 结论 半巢式PCR方法检测外套细胞淋巴瘤中bcl_1/IgH基因重排比一步法PCR敏感而特异。

半定量RT-PCR法检测赤霞珠葡萄白藜芦醇合酶STS基因的表达

以赤霞珠葡萄(Vitis vinifera L.)为材料,以Actin基因为内参,采用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测葡萄果实发育过程中白藜芦醇合酶(STS)基因表达量的变化,以期建立适于检测该基因表达的RT-PCR试验体系。结果表明,在退火温度58℃,扩增循环31次的时候,STS基因能够进行较好的扩增。在赤霞珠葡萄浆果发育的过程中,花后20、50 d STS基因表达量较少,在花后80 d表达量增到最大,花后110 d又降低。

应用巢式聚合酶链式反应技术检测孕妇人微小病毒B19非结构蛋白DNA

目的 探讨巢式PCR技术检测人微小病毒B19(B19病毒 )非结构蛋白DNA的灵敏性及特异性。方法 参照经典的巢式PCR技术检测B19病毒结构蛋白DNA的方法 ,检测 30例孕妇血清及胎盘绒毛组织中的B19病毒结构蛋白及非结构蛋白DNA。并与人巨细胞病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、腺病毒等及人类基因组DNA同批作巢式PCR检测 ,以观察巢式PCR检测B19病毒非结构蛋白DNA的特异性。结果 (1)巢式PCR检测B19病毒非结构蛋白DNA的最小检出量为 0 0 0 5fg ,灵敏性可达 0 0 0 5fg。 (2 )B19病毒质粒模板在 10 3bp处出现靶条带 ,而人巨细胞病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、腺病毒等及人类基因组DNA均无扩增产物产生。 (3)孕妇血清及胎盘、绒毛组织中的B19病毒结构蛋白检出率均为 2 6 7% (8/30 ) ,而非结构蛋白DNA检出率在血清中为 33 3% (10 /30 ) ,胎盘、绒毛组织中均为 2 6 7% (8/30 )。两者比较 ,差异均无显著性 (P >0 0 5 )。结论 巢式PCR技术检测B19病毒非结构蛋白DNA是一种灵敏、特异、简便、快速诊断B19病毒感染的新方法。

半巢式甲基化特异性聚合酶链反应在胃癌p16基因甲基化检测中的应用

目的 改进甲基化特异性聚合酶链反应 (MSP) ,采用半巢式MSP检测胃癌组织p16基因启动子区CpG岛的甲基化状态。方法 用亚硫酸氢盐修饰被测DNA后 ,采用半巢式MSP(引物分别为MS ,M1A和MS ,M2A) ,分析了 6 0例胃癌组织及相应正常组织中p16基因的甲基化状态。结果 单独用MSP ,胃癌组织中p16基因甲基化的发生率为 80 %。采用半巢式MSP ,甲基化发生率为86 7% ,比单独采用MSP提高了几个百分点 ,并提示胃癌病例的p16基因启动子区存在甲基化发生的不同模式。结论 半巢式MSP能够有效地提高灵敏度和减少假阳性。同时 ,免疫组化的结果也说明了p16基因异常甲基化与胃癌组织P16蛋白的表达密切相关。

半巢式聚合酶链反应方法检测弥漫性大B细胞淋巴瘤bcl-2/IgH基因重排

目的寻找一种敏感、特异的方法检测弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)bcl-2/IgH基因重排,并通过测定产物的序列,以了解所建方法的可靠性。方法运用专业引物设计软件设计bcl-2/IgH基因重排半巢式PCR引物,对52例经临床病理确诊的DLBCL石蜡包埋组织及10例慢性扁桃体炎患者的新鲜扁桃体组织通过半巢式递降温度梯度PCR(touch down PCR)扩增,检测bcl-2/IgH基因重排,并对其产物进行克隆和序列分析。结果通过一步法检测到bcl-2/IgH基因重排8例,其中DLBCL6例,新鲜扁桃体组织2例;进行第2次半巢式PCR时仅在DLBCL中发现5例阳性,新鲜扁桃体组织均阴性。将阳性产物在网上序列分析显示:一步法检测到的8例中有3例为假阳性,而半巢式PCR扩增出的5例均为bcl-2/IgH基因重排片段。3例假阳性的片段分别与人类第19号染色体BAC331191,LLNLR-245D11基因片段及1号染色体RP11-498P10基因片段同源。结论常用的检测bcl-2/IgH基因重排引物扩增结果存在一定假阳性,其机制可能是因为人类基因组中存在与常用引物同源性较高的序列。为研究设计的引物与传统的引物结合,进行半巢式PCR可以排除这种假阳性扩增,提高诊断的准确性。