半抗原-载体蛋白偶联物的三种电泳鉴定方法

【目的】建立一种简单方便的半抗原-载体蛋白偶联物电泳鉴定方法。【方法】选用SDS-PAGE、非变性琼脂糖凝胶电泳、高效毛细管区带电泳3种方法对载体蛋白、偶联剂变性的载体蛋白、半抗原-载体蛋白进行比较鉴定,同时与光谱法结果比较。【结果】对分子量差异较小的载体蛋白和半抗原-载体蛋白偶联物,SDS-PAGE不能有效分辨;但偶联前后载体电荷有变化时,非变性琼脂糖凝胶电泳却能有效分辨游离的载体蛋白和半抗原-载体蛋白偶联物,相对SDS-PAGE表现出更高的分辨灵敏度;毛细管区带电泳能高效分辨载体和半抗原-载体蛋白偶联物,结果直观,但需较贵重的专用仪器。琼脂糖电泳和毛细管电泳法与可见-紫外光谱法鉴定结果一致。【结论】3种电泳方法各有优缺点,非变性凝胶电泳简便、廉价、有效,较适合普通实验室使用。

荧光光谱法在半抗原-载体蛋白偶联物鉴定中的应用

对苯甲酸-牛血清白蛋白偶联物和苯胺-牛血清白蛋白偶联物进行荧光光谱鉴定。结果显示,对苯甲酸-牛血清白蛋白偶联物和苯胺-牛血清白蛋白偶联物的荧光光谱与其半抗原和载体蛋白相比均发生变化,苯甲酸-牛血清白蛋白偶联物和苯胺-牛血清白蛋白偶联物合成成功。研究表明,荧光光谱法是一种鉴定半抗原-载体蛋白偶联物的可行的方法。

一种改进的分泌抗半抗原抗体杂交瘤细胞株筛选方法

目的:研究解决半抗原分子单克隆抗体制备技术路径中遇到的在阳性杂交瘤细胞株筛选时无法排除载体蛋白间交叉反应影响的问题,以半抗原去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)为例。方法:在NE完全抗原免疫小鼠实施细胞融合后,分别包被牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、BSA-NE、OVA-NE等4种不同抗原的酶标板平行检测细胞培养上清液;挑选BSA、OVA检测结果为阴性,BSA-NE、OVA-NE检测结果为阳性的孔内细胞进行克隆化筛选单克隆细胞。结果:本筛选方法可一次性从8板96孔板中筛选到13个符合要求的阳性孔,经3次克隆化后获得6株特异性强的杂交瘤细胞株。结论:本方法避免了载体蛋白间交叉反应对筛选的影响,改进了传统的单一指标筛选方法,筛选效率更高。

石杉碱甲人工抗原的合成、鉴定及免疫原性分析

目的制备乙酰胆碱脂酶抑制活性成分石杉碱甲(huperzine A,HupA)的人工抗原及抗血清。方法将HupA与戊二醛、载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)反应偶联,制得半抗原-载体蛋白复合物后,用基质辅助激光解吸飞行时间质谱测定其中结合的半抗原数目;以此抗原免疫BALB/c小鼠,制备抗血清,并通过ELISA法检测其抗体效价和特异性。结果合成的人工抗原HupA-GA-BSA中HupA与BSA的结合比约为8∶1;免疫小鼠得到特异针对HupA的抗血清,HupA抗体的效价为1∶62500。结论成功地合成了HupA的人工抗原,且该抗原有较好的免疫原性。

25-羟基维生素D_3人工完全抗原的合成与鉴定

目的:合成25-羟基维生素D3人工完全抗原,并制备抗25-羟基维生素D3的特异性抗体。方法:将25-羟基维生素D3进行化学修饰加入羧基活性基团,合成具有半抗原结构特征的25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯。采用碳二亚胺法,将25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯,分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,合成人工完全抗原25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-BSA和25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-OVA。通过紫外吸收光谱,SDS-PAGE和MALDI-TOF进行偶联鉴定。用25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-BSA免疫小鼠,获得抗25-羟基维生素D3抗体免疫血清。结果:25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯与BSA的偶联比为(12±0.16)∶1,免疫小鼠后获得高效价(效价为6.25×10-4)的抗体,且标准品浓度在37.5～600 ng/mL范围具有显著的竞争性线性关系,检测的灵敏度为37.5 ng/mL。结论:成功合成了25-羟基维生素D3人工完全抗原,制备出25-羟基维生素D3的抗体且其线性关系显著,灵敏度较高,为进一步研制检测25-羟基维生素D3的试剂盒奠定了基础。

紫杉醇完全抗原的合成鉴定及免疫原性分析

目的制备红豆杉属植物中抗癌成分紫杉醇(paclitaxel,TAX)的人工抗原及抗血清,为获取分泌抗紫杉醇抗体的单克隆细胞系及分离单链抗体基因、进而以之提高植物中紫杉醇的量,及建立快速检测TAX的酶联免疫吸附测定(ELISA()法提供技术基础。方法将7-木糖基紫杉醇(7-xylotaxol,7-xyl-TAX)经NaIO4氧化打开糖环,与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)反应偶联,制得半抗原-载体蛋白复合物后,用基质辅助激光解吸飞行时间质谱测定其中结合的半抗原数目;以此抗原免疫BALB/c小鼠,制备抗血清,并通过ELISA法检测其抗体效价和特异性。结果合成的人工抗原TAX-BSA中TAX与BSA的结合比约为4～5∶1;免疫小鼠到特异针对TAX的抗血清,TAX抗体的效价为1∶3200。结论成功地合成了TAX的人工抗原,且该抗原有较好的免疫原性。