MALDI-TOF-MS法测定芍药苷-人血清白蛋白复合物的半抗原数

为建立中药活性成分的抗体测定技术平台,将中药活性成分芍药苷与人血清白蛋白偶联成完全抗原(半抗原-蛋白质复合物),并利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱(MALD I-TOF-MS)技术测定了上述人工抗原的基本质谱特征,求得了芍药苷-人血清白蛋白复合物的半抗原数(hapten number)为12.试验结果表明,利用MALD I-TOF-MS方法测定人工合成的半抗原-蛋白质复合物的质谱特征等,具有所需样品量少、结果准确和迅速可靠等优点,为药用植物活性成分的抗体技术研究提供了科学方法和试验依据,对于判断人工抗原的质量具有科学意义.

半抗原-载体蛋白偶联物的三种电泳鉴定方法

【目的】建立一种简单方便的半抗原-载体蛋白偶联物电泳鉴定方法。【方法】选用SDS-PAGE、非变性琼脂糖凝胶电泳、高效毛细管区带电泳3种方法对载体蛋白、偶联剂变性的载体蛋白、半抗原-载体蛋白进行比较鉴定,同时与光谱法结果比较。【结果】对分子量差异较小的载体蛋白和半抗原-载体蛋白偶联物,SDS-PAGE不能有效分辨;但偶联前后载体电荷有变化时,非变性琼脂糖凝胶电泳却能有效分辨游离的载体蛋白和半抗原-载体蛋白偶联物,相对SDS-PAGE表现出更高的分辨灵敏度;毛细管区带电泳能高效分辨载体和半抗原-载体蛋白偶联物,结果直观,但需较贵重的专用仪器。琼脂糖电泳和毛细管电泳法与可见-紫外光谱法鉴定结果一致。【结论】3种电泳方法各有优缺点,非变性凝胶电泳简便、廉价、有效,较适合普通实验室使用。

荧光光谱法在半抗原-载体蛋白偶联物鉴定中的应用

对苯甲酸-牛血清白蛋白偶联物和苯胺-牛血清白蛋白偶联物进行荧光光谱鉴定。结果显示,对苯甲酸-牛血清白蛋白偶联物和苯胺-牛血清白蛋白偶联物的荧光光谱与其半抗原和载体蛋白相比均发生变化,苯甲酸-牛血清白蛋白偶联物和苯胺-牛血清白蛋白偶联物合成成功。研究表明,荧光光谱法是一种鉴定半抗原-载体蛋白偶联物的可行的方法。

rhBMP-2复合生物活性玻璃诱导成骨的实验研究

目的:探讨生物活性玻璃(bioactiveglassBG)对重组人骨形成蛋白-2(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein-2,rhBMP-2)诱导骨形成的影响。方法:6只大鼠皮下袋植入rhBMP-2/BG,0.2mg0.5mgrhBMP-2,并设空白对照组。植入后3周行组织学检查。结果:0.5mg组rhBMP-2/BG具有成骨作用,其骨化过程类似于膜内化骨的直接骨形成。结论:rhBMP-2/BG复合物能诱导新骨形成,表明BG适合作为rhBMP-2载体。

重组人骨形态发生蛋白-2抗体的制备及纯化

骨形态发生蛋白-2是骨科研究领域的重要生物蛋白。用重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP2)与BSA连接成复合物作为免疫原,免疫家兔制备出多克隆抗血清。分别用免疫沉淀法和Sepharose4B-BSA反向免疫亲和吸附法去除抗血清中载体BSA抗体。用盐析法和蛋白层析法纯化出抗rhBMP2抗体。研究发现,家兔产生高效价抗体的最佳时间为14-16周,从rhBMP2抗体的特异性、相对纯度及回收率综合分析,免疫沉淀法去除BSA抗体优于反相亲和吸附法。

25-羟基维生素D_3人工完全抗原的合成与鉴定

目的:合成25-羟基维生素D3人工完全抗原,并制备抗25-羟基维生素D3的特异性抗体。方法:将25-羟基维生素D3进行化学修饰加入羧基活性基团,合成具有半抗原结构特征的25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯。采用碳二亚胺法,将25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯,分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,合成人工完全抗原25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-BSA和25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-OVA。通过紫外吸收光谱,SDS-PAGE和MALDI-TOF进行偶联鉴定。用25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-BSA免疫小鼠,获得抗25-羟基维生素D3抗体免疫血清。结果:25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯与BSA的偶联比为(12±0.16)∶1,免疫小鼠后获得高效价(效价为6.25×10-4)的抗体,且标准品浓度在37.5～600 ng/mL范围具有显著的竞争性线性关系,检测的灵敏度为37.5 ng/mL。结论:成功合成了25-羟基维生素D3人工完全抗原,制备出25-羟基维生素D3的抗体且其线性关系显著,灵敏度较高,为进一步研制检测25-羟基维生素D3的试剂盒奠定了基础。

完全抗原与半抗原有何不同？

答：具有免疫原性，同时又具有反应原性的物质称为完全抗原，如异种血清蛋白。只有反应原性而无免疫原性的物质称为半抗原或不完全抗原。半抗原分子量很小，本身没有免疫原性，但与蛋白载体结合后可获得免疫原性。载体通常是大分子蛋白质，它们能与做为抗原决定簇的半抗原分子结合，从而形成半抗原-载体复合物。这种复合物通常具有半抗原和载体蛋白特异的免疫原性，或只具有半抗原特异的免疫原性。如青霉素的降解产物青霉烯酸即为半抗原，与人体蛋白结合形成青霉烯酸蛋白而成为具有免疫原性的完全抗原。

石杉碱甲人工抗原的合成、鉴定及免疫原性分析

目的制备乙酰胆碱脂酶抑制活性成分石杉碱甲(huperzine A,HupA)的人工抗原及抗血清。方法将HupA与戊二醛、载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)反应偶联,制得半抗原-载体蛋白复合物后,用基质辅助激光解吸飞行时间质谱测定其中结合的半抗原数目;以此抗原免疫BALB/c小鼠,制备抗血清,并通过ELISA法检测其抗体效价和特异性。结果合成的人工抗原HupA-GA-BSA中HupA与BSA的结合比约为8∶1;免疫小鼠得到特异针对HupA的抗血清,HupA抗体的效价为1∶62500。结论成功地合成了HupA的人工抗原,且该抗原有较好的免疫原性。

紫杉醇完全抗原的合成鉴定及免疫原性分析

目的制备红豆杉属植物中抗癌成分紫杉醇(paclitaxel,TAX)的人工抗原及抗血清,为获取分泌抗紫杉醇抗体的单克隆细胞系及分离单链抗体基因、进而以之提高植物中紫杉醇的量,及建立快速检测TAX的酶联免疫吸附测定(ELISA()法提供技术基础。方法将7-木糖基紫杉醇(7-xylotaxol,7-xyl-TAX)经NaIO4氧化打开糖环,与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)反应偶联,制得半抗原-载体蛋白复合物后,用基质辅助激光解吸飞行时间质谱测定其中结合的半抗原数目;以此抗原免疫BALB/c小鼠,制备抗血清,并通过ELISA法检测其抗体效价和特异性。结果合成的人工抗原TAX-BSA中TAX与BSA的结合比约为4～5∶1;免疫小鼠到特异针对TAX的抗血清,TAX抗体的效价为1∶3200。结论成功地合成了TAX的人工抗原,且该抗原有较好的免疫原性。