禽腺病毒细胞病变观察和半数组织感染量测定

从贵州省的患病鸡群中分离出一株禽腺病毒，暂定名为ＨＳ—１。ＨＳ一１毒株能够在鸭胚成纤维细胞上生长良好，第１代即出现明显的细胞病变，细胞培养上清液中病毒的血凝效价达到２￣（１３）。采用交叉血凝抑制试验证实，贵州分离毒ＨＳ－１与标准毒株ＡＶ—１２７属于同一血清型或相关血清型，其半数组织感染量经测定达到１０￣（－３．５８）／０．

J亚群禽白血病病毒TCID_(50)不同测定方法的比较

为比较不同方法在测定J亚群禽白血病病毒(ALV-J)组织细胞半数感染量(TCID50)上的差异,将ALV-J传染性克隆r NX0101株同一病毒保存液以10倍梯度稀释后按照常规方法分别接种已长满DF-1细胞和鸡胚成纤维细胞(CEF)的96孔板,维持7 d后取所有细胞培养上清以ALV-p27抗原检测试剂盒检测p27抗原,细胞固定后以ALV-J特异性单克隆抗体JE9进行间接免疫荧光(IFA)检测,确定病毒感染孔后按照Reed-Muench法分别计算两种方法在两种细胞上的TCID50。结果显示,ELISA法测定该病毒在DF-1细胞和CEF细胞上的TCID50分别为10-5.4TCID50/0.1 m L和10-4.666TCID50/0.1 m L,而IFA法测定该病毒在DF-1和CEF细胞上的TCID50分别为10-6.333TCID50/0.1 m L和10-5.2TCID50/0.1 m L。结果表明,IFA比ELISA具有更高的灵敏度,并且ALV-J在DF-1细胞上复制能力比CEF更强,在DF-1细胞上测定ALV-J的TCID50更为科学。

2009-2011年市售商品化猪流行性乙型脑炎弱毒活疫苗的质量评估

为了解目前市售商品化猪流行性乙型脑炎弱毒活疫苗的质量,利用TCID50效价测定和RT-PCR 2种方法对2009-2011年市场销售的主要国产疫苗产品进行了检测。结果发现,目前市售的疫苗产品中活病毒含量差异较大,虽然部分产品可达103.80 TCID50/头份,但有些产品含量极低。RT-PCR检测结果与TCID50效价测定的结果基本一致。这表明目前市售的乙脑疫苗质量良莠不齐,部分疫苗的抗原含量可能难以满足生产要求,这为规模化猪场乙脑防控的疫苗选择提供了重要参考依据。

细胞密度和感染复数对SARS病毒在Vero细胞中增殖的影响

阐明宿主细胞密度和病毒感染复数(MOI)对SARS冠状病毒增殖的影响,为SARS灭活疫苗的研究奠定基础。采用析因设计方法,考虑MOI(0.01、0.05和0.1)与细胞密度(2×104、4×104和8×104/cm2)2个3水平实验因素,在各水平组合条件下培养SARS病毒,以组织培养半数感染量(TCID50)作为观测指标,分析SARS冠状病毒滴度在不同增殖条件下的差异。结果表明,MOI、宿主细胞密度和二者之间的交互作用对SARS病毒滴度的影响分别具有非常显著性差异(F=12.70,P<0.01)、显著性差异(F=6.94,P<0.05)和非常显著性差异(F=8.22,P<0.01)。在0.01MOI和8×104/cm2条件下,病毒滴度达5.57×105TCID50/mL。说明SARS冠状病毒在培养细胞中的增殖能力显著依赖于宿主细胞密度、病毒感染复数和二者的交互作用。

Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)在鸡胚中的增殖及感染力的测定

为确定所分离Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)毒力,为DHV单克隆抗体研究做好前期准备。将Ⅰ型鸭肝炎病毒接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔(0.2 mL/胚)进行增殖,制备鸡胚成纤维细胞(CEF),并分别运用鸡胚半数致死量(CELD50)法和组织培养半数感染量(TCID50)法测定DHV的感染力。结果显示,DHV-Ⅰ在SPF鸡胚内成功增殖,致死鸡胚具有典型临床症状和体表特征,所增殖病毒的CELD50和TCID50分别为10-5.6/0.2 mL和10-5.12/0.1 mL。结果表明,该分离毒株毒力较强,是进行DHV单克隆抗体研究的理想抗原。

新城疫不同毒株EID_(50)的测定及增殖速度的比较

新城疫是严重危害养禽业的疾病之一。本试验通过对新城疫不同毒株的EID50的测定以及增殖速度的比较,得出以下结论:在接种相同病毒量的情况下,新城疫病毒毒力越强,增殖速度越快,导致鸡胚死亡的时间越短。

肠炎型犬细小病毒的分离鉴定及病毒滴度测定

为获得肠炎型犬细小病毒分离株,采集犬细小病毒胶体金初检阳性的3份粪便,采用同步接毒法分别接种猫肾细胞(F81)和犬肾细胞(MDCK)进行分离培养,F81盲传至第2代出现细胞病变,MDCK盲传至第3代出现细胞病变,2种细胞均仅从病料3中分离出1株病毒。采用PCR方法鉴定该分离株为犬细小病毒并命名为CPV3。根据VP2基因核苷酸序列绘制的系统进化树及其推导氨基酸序列的分析,确定CPV3属于CPV-2a亚型。测定CPV3在MDCK中72 h时的组织细胞半数感染量(TCID50),第5代次(CPV-M-5)和第10代次(CPV-M-10)的TCID50数值分别为10-4. 83/0. 1 mL和10-5. 50/0. 1 mL,这为后续测定重组犬干扰素活性试验提供了材料。

MEK1/2抑制剂U0126抑制肠道病毒71型的复制

为了揭示肠道病毒71型(enterovirus71,EV71)的复制与宿主细胞Raf/MEK/ERK信号通路(简称ERK通路)的相互关系,本研究应用临床诊断为手足口病的患儿疱疹液,通过易感细胞分离培养、RT-PCR及序列测定,以及Western印迹技术等方法,成功分离到EV71临床株.进一步用该分离株感染易感细胞,通过观察宿主细胞p-ERK1/2蛋白磷酸化水平、病毒特异性衣壳蛋白VP1水平、病毒半数组织培养感染量(50%tissue culture infectious dose,TCID50),以及感染细胞的CPE等指标,以期揭示ERK通路在EV71复制的作用.结果表明,EV71的复制可引起细胞ERK通路的活化;而用MEK1/2特异性的抑制剂U0126预先抑制ERK通路的活化,可显著地降低受染细胞上清液中的病毒的感染滴度(以TCID50表示)、受染细胞中EV71VP1蛋白水平、受染细胞中EV71核酸水平,以及受染细胞的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE).提示ERK信号通路的活化对EV71的复制具有重要的作用.本研究为进一步阐明EV71在宿主细胞内的复制机制、寻找新型抗病毒靶标等研究奠定了良好的基础.

柯萨奇B病毒诱导小鼠心肌病变的实验研究

目的研究柯萨奇B病毒感染对ICR小鼠心肌组织亲嗜性及损害作用,探讨病毒感染与心肌病变之间的关系。方法ICR小鼠130只随机分为感染组(120只)和对照组(10只),感染组再分为CVB3组(60只)和CVB4组(60只)。CVB3组每只腹腔注射4×100 TCID50 CVB3/MKP 0.2ml,CVB4组每只腹腔注射4×100TCIDSO CVB4/jlu06 0.2ml,对照组每只腹腔注射PBS0.2ml。分别在感染后1、4、8、15、27和60 d处死小鼠,无菌取心肌组织,收集血液分离血清,用于病毒滴度的测定及病理学分析。结果两株病毒均在小鼠心肌组织中有较高滴度增殖,并导致了小鼠心肌组织不同程度的损害。结论CVB3/MKP株具有较强的心肌亲嗜性,可引起ICR小鼠心肌组织的严重损伤,该株病毒感染可能与心肌炎的发生密切相关。

中药多糖对鸡新城疫IV系疫苗抗原活力的影响

将中药多糖加入冻干保护剂中,与新城疫IV系病毒同时冷冻干燥制苗,测定病毒的鸡胚半数感染量(EID50),观察中药多糖对鸡新城疫IV系疫苗抗原活力的影响。结果表明,供试中药多糖对鸡新城疫IV系疫苗抗原活力无不良影响。

貉细小病毒病动物模型的建立

为了建立貉细小病毒病发病模型,试验将20只试验貉随机分成5组,分别为1×10^(7.50)TCID_(50)组(Ⅰ组)、1×10^(6.50)TCID_(50)组(Ⅱ组)、1×10^(5.50)TCID_(50)组(Ⅲ组)、1×10^(4.50)TCID_(50)组(Ⅳ组)和对照组(Ⅴ组,注射MEM培养基),每组4只,Ⅰ~Ⅳ组灌服貉细小病毒HeB17株P5代(病毒含量为1×10^(7.50)TCID_(50)/mL),每只攻毒总剂量为5 mL/次。以攻毒貉的精神状态、食欲情况、粪便性状、粪便排毒、白细胞数及组织病理学检测结果作为观测指标,根据每组貉的发病数量计算半数感染量(ID_(50))。结果表明:在攻毒后4~9天貉出现了明显的临床症状,如精神沉郁或萎靡、食欲减退或废绝、腹泻、排血便等,严重者出现昏迷、死亡;发病貉剖检可见消化道肿胀、充血、出血、肠壁变薄。病理组织切片可见肠组织的黏膜上皮、固有层肠腺发生广泛变性、坏死等病理变化,黏膜下层大量结缔组织增生;脾脏淋巴细胞数较对照组减少;此外,攻毒貉在攻毒后第4,5天开始出现粪便排毒情况,白细胞数在也在攻毒后第2,3天开始下降。根据不同剂量攻毒结果计算得到貉细小病毒HeB17株(病毒含量为1×10^(7.50)TCID_(50)/mL)的ID_(50)为1×10^(-2.5)/5 mL,攻毒剂量为100ID_(50),即貉细小病毒HeB17株稀释至1×10^(7.00)TCID_(50)/mL,攻毒体积为5 mL。说明貉细小病毒HeB17株可以作为评价貉细小病毒病灭活疫苗的标准毒株,本研究成功建立了貉细小病毒病发病模型。

Vero细胞中禽呼肠孤病毒的增殖特性研究

为了研究绿猴肾（Vero）细胞中禽呼肠孤病毒（ARV）的增殖特性,试验采用了光学显微镜观察、半数组织感染量（TCID50）测定、RT-PCR检测等方法对细胞培养物进行了研究。结果表明:ARV S1133毒株在Vero细胞中能有效增殖,并出现细胞破碎、萎缩、抱团、脱落、边缘模糊、胞体变大,甚至死亡等典型的细胞病变（CPE）;RT-PCR检测成功扩增出一条大小为1 248 bp的条带;ARV在感染Vero细胞后会经历三个时期,即潜伏期、快速增长期、稳定期,并在稳定期病毒效价达到峰值,TCID50为1×10-8.46/0.1 m L。

流感病毒H1N1在MDCK细胞的培养及纯化条件的优化

目的优化流感病毒H1N1在狗肾细胞(MDCK)上的培养条件,高效扩增流感病毒。方法对MDCK细胞培养流感病毒时添加的胰酶(TPCK-Trypsin)浓度和培养基的种类进行筛选;比较不同细胞代次的MDCK对流感病毒的易感性;按MOI值0.001、0.01、0.1接种H1N1于MDCK细胞,CPE>75%时收获病毒上清,并按MOI值0.001接种H1N1后连续培养,分别于1、2、3、4、5d收获病毒上清,HA试验检测上清病毒滴度,浓缩纯化后行TCID50检测,分别选取最佳接种MOI值和收毒时间;对浓缩纯化病毒的红细胞吸附方法进行检验。结果通过对比,确定TPCK-Trypsin的最佳使用浓度是0.25μg/ml,MEM为培养病毒的最佳培养介质;代次低的MDCK对流感病毒的易感性强于代次高的MDCK细胞;按MOI值0.001接种H1N1于MDCK细胞,第3d收获的上清病毒滴度最高,为1∶1 024;用红细胞吸附法浓缩纯化流感病毒的Log 1/TCID50为8.5。结论选用MEM,添加0.25μg/ml TPCK-Trypsin,使用低代次MDCK,病毒接种含量MOI=0.001为H1N1最佳培养条件,红细胞吸附法能高效浓缩纯化培养上清中的H1N1。

兽用生物制品中常用的英文缩写

LD50(半数致死量)表示致病微生物(或其毒素)以特定的途径接种动物，在一定时间内能致死50％动物的剂量。