鲫鱼(Carassius auratus)半胱亚磺酸脱酸酶CSAD基因克隆及其表达研究

本研究以鲫鱼(Carassius auratus)为研究对象,采用巢式PCR和RACE技术克隆鲫鱼半胱亚磺酸脱酸酶CSAD基因c DNA序列,并且利用实时荧光定量PCR检测了CSAD m RNA在鲫鱼不同组织和昼夜节律中的相对表达水平,同时还研究了牛磺酸对鲫鱼肠道CSAD m RNA表达的影响。结果表明:(1)鲫鱼CSAD基因c DNA序列包含186bp的5?UTR序列,675bp的3?UTR序列,1503bp开放阅读框,编码500个氨基酸。同源性分析表明,鲫鱼和鲤鱼的同源性为97.2%。系统发育分析表明,鲫鱼与鲤鱼之间的亲缘关系最接近,置信度为100。经预测,其编码的蛋白质的分子量和等电点分别为56.82k Da和5.77;(2)Ca CSAD m RNA在肌肉、心脏、肠道及肝脏中的表达水平较高,在脑和鳃组织中的相对表达量较低;(3)鲫鱼肠道CSAD m RNA的相对表达量在6:00am点时最高,9:00pm点时相对表达量最低;(4)鲫鱼CSAD的相对表达丰度随着牛磺酸添加量的增加而逐渐下降。本研究结果不仅有助于理解鲫鱼CSAD基因的分子特征,同时将为进一步研究鱼类CSAD营养调控功能提供理论依据。

埃及伊蚊来源半胱亚磺酸脱羧酶的性质解析

原核来源L-天冬氨酸-α-脱羧酶的活性较低,是限制生物法合成β-丙氨酸的主要因素,该研究将目光由原核来源转向真核来源,意在寻找具有更高催化活性的酶。该文通过基因合成获得埃及伊蚊来源半胱亚磺酸脱羧酶,并添加sumo标签实现了其在大肠杆菌中的高效表达,酶学性质表征实验结果表明,重组酶可催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸,比酶活力为(5.00±0.074)U/mg,添加sumo标签后比酶活力为(5.40±0.129)U/mg;最适反应条件为40℃,pH 6.0;带标签酶的稳定性要明显优于野生型,在50℃处理30 min后酶活力仍保留40%,在pH 5.0~8.0酶活力都维持在80%左右。利用大肠杆菌自身的天冬氨酸裂解酶与重组半胱亚磺酸脱羧酶相偶联,实现了从富马酸到天冬氨酸的一步转化,产物的摩尔转化率达到93.03%。该研究中半胱亚磺酸脱羧酶对于L-天冬氨酸具有较高的催化活性,为β-丙氨酸的工业化生产提供理论支持和技术参考。

家蚕微孢子虫半胱氨酸脱硫酶基因的克隆及表达和亚细胞定位

半胱氨酸脱硫酶是一类活性依赖于磷酸吡哆醛的酶类,可催化L-半胱氨酸转化为L-丙氨酸和硫烷硫原子,为铁硫簇组装提供硫原子。基于家蚕微孢子虫基因组数据,克隆了家蚕微孢子虫半胱氨酸脱硫酶(NbNfs)基因。序列结构分析显示NbNfs含有其活性所需的保守氨基酸位点,但不具有线粒体型N端导肽;系统发育分析表明微孢子虫半胱氨酸脱硫酶与真菌线粒体型半胱氨酸脱硫酶聚为一类,属于类群Ⅰ,起源于α-变形细菌;共线性分析表明半胱氨酸脱硫酶基因在不同微孢子虫之间其基因座位保守,具有共线性。构建重组质粒pET30a(+)-NbNfs,并转化到E.coli Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达NbNfs融合蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化后,将融合蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,Western blotting检测NbNfs在成熟家蚕微孢子虫具有表达。胶体金免疫定位显示NbNfs主要定位于成熟家蚕微孢子虫的细胞质中。研究结果为家蚕微孢子虫铁硫簇组装途径的研究奠定了基础。

半胱氨酸脱硫酶突变体H104Q,E156Q,D180G,Q183E和K206A通过改变对磷酸吡哆醛的结合影响酶活性

大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶(cysteine desulfurase,Isc S)是一类依赖磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate,PLP)的同质二聚体的酶.IscS能催化游离底物L-半胱氨酸脱硫,生成L-丙氨酸和单质硫.在此催化过程中,可形成与酶结合的半胱氨酸过硫化物中间物,并出现了7种具有不同特征性吸收峰的中间反应物.为了研究PLP的结合及中间反应物的形成及累积,对IscS中与PLP结合相关,及IscS半胱氨酸活性口袋中特定氨基酸残基位点(His104,Glu156,Asp180,Gln183和Lys206)进行定点突变,结果发现:1)IscS突变体H104Q、D180G、Q183E、K206A对PLP的结合能力具有不同程度的减弱,酶的活性明显降低甚至消失,PLP与蛋白结合的特异吸收峰消失,或发生明显偏移并出现新的吸收峰,且这些新出现的吸收峰又与蛋白形成的各种中间反应物的吸收峰一致;2)IscS突变体E156Q的活性增高,PLP与蛋白结合的吸收峰明显增加.这些结果都表明,IscS氨基酸残基可通过影响PLP的结合及质子转移引起催化过程中不同中间反应物的形成及累积,同时提高或降低蛋白的活性.

同型半胱氨酸代谢相关酶基因多态性与先天性心脏病的关系

目的研究同型半胱氨酸相关酶中亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、蛋氨酸合成酶(MS)和蛋氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因的多态性与先天性心脏病(CHD)的相关性。方法采用病例对照研究方法,以132例CHD患儿(疾病组)与107名健康儿童(对照组)的血白细胞为样本,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术检测两组的MTHFR基因第677位点、MS基因第2756位点及MTRR第66位点的多态性,比较两组各自的基因型和等位基因的分布频率。结果MTHFR的677位点CC、CT和TT基因型在疾病组中分别为22.73%、51.52%、25.76%,在对照组中分别为42.99%、44.86%、12.15%,两组的分布频率差异有统计学意义。MS基因第2756位点AA、AG和GG基因型在疾病组和对照组中的分布频率差异无统计学意义。MTRR基因第66位点AA、AG和GG基因型在疾病组分别为25.00%、63.64%、11.36%,在对照组中分别为48.60%、42.05%、9.35%,两组的分布频率差异有统计学意义。结论①MTHFR及MTRR的基因多态性与CHD的发病具有一定程度的相关性,MS基因的多态性分布与CHD的发病无关;②MTHFR基因第677位点中的C/C及MTRR第66位点中的A/A均为CHD的保护基因;③两基因变异在CHD的发病中可能有协同作用。

冠心病患者亚甲基四氢叶酸还原酶基因的多态性

目的研究冠心病患者亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)677位(C-T)多态性及其与血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平、冠心病之间的关系。方法聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析冠心病组(冠脉造影显示至少有一支血管狭窄≥50%)122例与对照组(冠脉造影未发现任何可辨认斑块或狭窄)56例MTHFR677位(C-T)多态性;荧光衍生后高相液相色谱法检测血浆总Hcy水平。SPSS 11.5统计软件分析。结果(1)MTHFR 677位(C-T)有3种基因型(TT,TC,CC),两组基因型分布和等位基因频率分布差异有统计学意义(P<0.05)。(2)冠心病组Hcy水平[μmol/L,(12.99±4.76)]高于对照组(10.95±4.75)(P<0.05)。冠心病、基因型对Hcy水平都有影响(P<0.001)。(3)TT型Hcy水平(15.45±4.41)高于CC型及TC型[分别为(10.49±3.73),(11.55±4.88),P<0.001]。TC基因型与CC基因型Hcy差别无统计学意义(P>0.05)。结论MTHFR 677位C-T多态性与冠心病可能有关;Hcy与冠心病和MTHFR 677位C-T多态性可能有关。

血浆同型半胱氨酸水平及N^5,N^(10)-亚甲四氢叶酸还原酶基因多态性与老年期抑郁症的关联研究

目的探讨血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平及N5,N10-亚甲四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性与老年期抑郁症发病的关系。方法采用毛细管电泳-紫外检测法、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术测定60例老年期抑郁症患者(抑郁症组)和80名正常人(对照组)的血浆总Hcy水平和MTHFR基因多态性。患者入组时评定汉密尔顿抑郁量表(HAMD),治疗第6周末评定疗效(HAMD减分率≥50%为有效,<50%为无效)。结果(1)抑郁症组的血浆Hcy水平[(17±6)μmol/L]明显高于对照组[(12±4)μmol/L],差异有统计学意义(P<0.01)。<60岁首次发病(以下简称首发)患者(n=30)的血浆Hcy水平[(16±5)μmol/L]与≥60岁首发患者[n=30,(19±6)μmol/L]的差异无统计学意义(P>0.05);单次发作患者(n=17)的血浆Hcy水平[(18±6)μmol/L]与反复发作患者[n=43,(17±5)μmol/L]的差异无统计学意义(P>0.05);伴心脑血管疾病患者(n=27)的血浆Hcy水平[(19±6)μmol/L]与不伴心脑血管疾病患者[n=33,(16±5)μmol/L]的差异无统计学意义(P>0.05);治疗有效患者(n=40)的血浆Hcy水平[(18±5)μmol/L]与治疗无效患者[n=20,(17±6)μmol/L]的差异无统计学意义(P>0.05)。(2)抑郁症组治疗前后HAMD评分的减分率与血浆Hcy水平无显著相关性(P>0.05)。(3)MTHFRC677T基因型有3种,即纯合子突变型(T/T)、杂合子突变型(T/C)和野生型(C/C)。抑郁症组的基因型及等位基因频率与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。抑郁症组患者的首发年龄、发病次数、是否伴发心脑血管疾病及抗抑郁药治疗第6周末的疗效与MTHFRC677T基因型分布均无关联(P>0.05)。(4)不同基因型的受试者(不论是抑郁症组还是对照组)血浆Hcy水平的差异无统计学意义(P>0.05)。结论血浆Hcy水平升高可能是老年期抑郁症发病的一个独立危险因素。

不同血清学指标对肺炎支原体肺炎患儿预后不良的预测价值

目的分析不同血清学指标对肺炎支原体肺炎(Mycoplasmal pneumoniae pneumonia,MPP)患儿预后不良的预测价值。方法选取2018年7月至2020年2月于徐州医科大学附属徐州儿童医院住院的MPP患儿100例为研究对象,按照疾病严重程度将其分别纳入重症组(50例)和普通组(50例),另选取该院同期体检健康儿童50例纳入对照组,分别检测重症组和普通组患儿急性期和恢复期血清红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)和D-二聚体(D-dimer,DD)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、T细胞亚群(CD3^+T细胞、CD4^+T细胞、CD8^+T细胞)、同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、γ干扰素(interferon-gamma,IFN-γ)水平,计算CD4^+T细胞/CD8^+T细胞比值,并与对照组进行比较。采用受试者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线)分析上述血清学指标对MPP患儿预后不良的预测价值。结果在急性期和恢复期,重症组患儿血清ESR和DD、LDH、Hcy、IL-6、IFN-γ水平均显著高于普通组(均P<0.05),且两组患儿上述指标水平均显著高于对照组(均P<0.05);重症组患儿血清CD3^+T细胞、CD4^+T细胞水平和CD4^+T细胞/CD8^+T细胞比值均显著低于普通组(均P<0.05),且两组患儿上述指标水平均显著低于对照组(均P<0.05)。随访6个月后,100例MPP患儿预后不良25例,预后良好75例。预后不良组患儿血清ESR和DD、LDH、Hcy、IL-6、IFN-γ水平均显著高于预后良好组(均P<0.05),CD3^+T细胞和CD4^+T细胞水平均显著低于预后良好组(均P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示:血清ESR、DD、LDH、CD3^+T细胞、CD4^+T细胞、Hcy、IL-6和IFN-γ均是MPP患儿预后的独立影响因素(均P<0.05)。血清ESR和DD、LDH、CD3^+T细胞、CD4^+T细胞、Hcy、IL-6、IFN-γ水平预测MPP患儿预后不良的曲线下面积分别为0.76、0.79、0.81、0.69、0.72、0.84、0.72和0.80。结论血清ESR和DD、LDH、CD3^+T细胞、CD4^+T细胞、Hcy、IL-6、IFN-γ水平对MPP患儿预后有一定的预测价值。