半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Caspase)及其在细胞凋亡中的作用

白细胞介素β转化酶,即ICE,与线虫死亡基因产物Ced-3蛋白相似,目前已发现14种ICE类似物,Alnemri将ICE家族统一命名为Caspase(Cystein-asparate protease,半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶),Caspase以结构酶原形式广泛存在于细胞。Caspase酶原主要经细胞色素C及死亡受体激活。Caspase活性中心含半胱氨酸,其选择性裂解底物天冬氨酸后残基,通过对蛋白激酶、核酸酶及细胞骨架的裂解,Caspase可激活特定信号系统,产生核皱缩,DNA片段形成等凋亡现象,最终导致细胞死亡,Caspase特异性抑制剂可抑制此作用。许多基因与Caspase参与的凋亡有关。

caspase-2:一种特殊的半胱天冬酶

半胱天冬酶(caspases)依赖的凋亡途径是细胞程序性死亡的一种重要方式,涉及到多个半胱天冬酶的级联反应。其中caspase-2是最早被鉴定的caspase家族成员之一,但是由于缺乏关于cas-pase-2活化机制的知识以及缺少特异性检测活性的方法,其研究受到限制。最近几年,对该酶的研究取得了一些新的重要进展,大量证据表明caspase-2在细胞凋亡调控中发挥着关键而独特的作用,本文对此予以概述。

半胱天冬酶3靶向分子影像探针在肿瘤细胞凋亡监测中的应用进展

细胞凋亡与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。因此,早期动态监测细胞凋亡对恶性肿瘤治疗效果评估以及指导后续治疗具有重要意义。分子影像是一种新兴的无创显像技术,能够可视化单个分子或特定细胞亚群,从而反映活体状态下分子水平变化。半胱天冬酶3(Caspase-3)是细胞凋亡的半胱天冬酶级联反应过程中至关重要的死亡执行蛋白酶,能够启动细胞内蛋白的特异性降解,从而诱导细胞凋亡。设计靶向Caspase-3的分子影像探针,能够实时监测治疗过程中肿瘤部位Caspase-3表达,精准评估治疗效果,从而为个体化治疗提供可靠依据。根据与Caspase-3不同的作用方式,Caspase-3分子影像探针主要分为Caspase-3抑制剂类和Caspase-3多肽底物类分子影像探针。这两类探针对Caspase-3均具有良好的靶向特异性和选择性,已成功应用于实时显像小鼠或人体治疗早期的肿瘤细胞凋亡。但这些探针仍有一定不足,如灵敏度低、组织背景高、代谢速度快等,尚需进一步优化。

依托咪酯对视神经损伤成年大鼠视网膜神经节细胞的保护作用及对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、脑源性神经营养因子蛋白表达的影响

目的:探讨依托咪酯对视神经损伤成年大鼠视网膜神经节细胞的保护作用及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白表达的影响。方法:选择成年雄性SD大鼠40只,随机选8只为正常照组,其余32只采用动脉夹夹持法损伤视神经建立视神经损伤模型并分组,即模型组(视神经损伤大鼠),依托咪酯低、中、高剂量组(依托咪酯腹腔注射),剂量分别为2、4、6 mg/kg。分析比较干预后各组大鼠眼压变化。并行HE染色观察视网膜组织结构,比较各组大鼠视网膜神经节细胞(RCGs)存活数目及存活率,Western blot法检测视网膜组织中Caspase-3、BDNF蛋白表达。结果:模型组、依托咪酯各组眼压高于正常组,依托咪酯各组末次给药后眼压降低,且呈剂量依赖性(均P<0.05)。模型组大鼠视网膜水肿增厚,以神经纤维层最为明显,且有空泡,RGC细胞肿胀,内、外核层细胞数量减少,排列紊乱。依托咪酯各组视网膜病理损伤均有改善,高剂量组好于中剂量组,中剂量组好于低剂量组。与正常组比较,模型组大鼠RCGs存活数目减少(P<0.05),与模型组比较,依托咪酯各组RCGs存活数目增多(P<0.05)。依托咪酯高剂量组RCGs存活数目、相对存活率高于中、低剂量组(均P<0.05)。正常组大鼠视网膜组织中BDNF蛋白表达高于模型组,Caspase-3低于模型组,依托咪酯各组视网膜组织中BDNF升高,Caspase-3下降,均呈剂量依赖性(均P<0.05)。结论:Caspase-3蛋白在大鼠视神经损伤中表达升高,BDNF蛋白表达降低,依托咪酯干预能够促进视网膜RGCs存活,对视神经损伤具有保护作用。

生存蛋白和半胱天冬酶-8在肝癌中的表达及其临床意义

目的研究生存蛋白(survivin,Surv)和半胱天冬酶8(caspase8,Casp8)在肝细胞癌(HCC)(肝癌)中的表达与细胞凋亡的关系。方法应用免疫组化SP法检测42例肝癌、42例癌旁组织和12例正常肝组织石蜡切片中Surv和Casp8的表达情况。结果Surv在正常肝组织中无表达。在癌旁组织和HCC中的表达率分别为7.14%和78.6%,二者差异显著(P<0.01)。阳性表达细胞表现为细胞质内有棕黄色颗粒,核内无表达; Casp8在正常肝组织中、癌旁组织和HCC中的表达率分别为91.7%、85.7%、57.14%,其中HCC与前二者比较差异显著(P<0.05).而癌旁组织和正常组织比较无差异(P>0.05)。阳性表达细胞表现为细胞质内有棕黄色颗粒;二者的表达与肿瘤组织学分级和转移密切相关。组织学分级越低以及有肝内外转移或转移倾向者,Surv表达率越高(P<0.05),而Casp8表达率越低(P<0.05)。结论Surv在HCC中稳定高效表达.可通过抑制Casp8活性而抑制细胞凋亡;Surv高表达和Casp8低表达可作为HCC独立的不良预后因子。

西洋参茎叶皂苷对大鼠局灶性脑缺血后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8表达的影响

目的研究西洋参茎叶皂苷(PQS)对大鼠局灶性脑缺血后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(caspase-8)表达的影响,并进一步探讨其机制。方法采用线栓法阻断大鼠一侧大脑中动脉(MCAO),制备局灶性脑缺血模型,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测大脑皮质凋亡相关基因caspase-8mRNA表达。结果模型组caspase-8mRNA表达较PQS高剂量组、PQS低剂量组、尼莫地平组、假手术组均明显增加(0.713±0.117 vs 0.467±0.089、0.552±0.099、0.468±0.097、0.422±0.077,P<0.01);而其他组间caspase-8mRNA表达差异均无统计学意义。结论PQS对大鼠局灶性脑缺血具有保护作用,其机制可能与西洋参茎叶皂苷抑制神经元细胞凋亡有关。

银屑病患者血清细胞因子白细胞介素-17、半胱天冬酶-1、白细胞介素-18的变化情况

目的探讨银屑病患者血清细胞因子白细胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)、半胱天冬酶-1(caspase-1)、白细胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)的变化情况。方法选择寻常型银屑病患者80例为银屑病组,健康体检者80例为对照组。酶联免疫吸附实验法测定两组血清IL-17、caspase-1、IL-18水平。结果银屑病组患者血清IL-17、caspase-1、IL-18水平分别为(215.46±19.78)pg/mL、(112.31±12.14)pg/mL、(134.25±18.85)pg/mL,对照组患者血清IL-17、caspase-1、IL-18水平分别为(142.31±7.80)pg/mL、(43.25±5.65)pg/mL、(62.97±12.13)pg/mL,两组血清IL-17、caspase-1、IL-18水平比较差异均有统计学意义(P=0.000、0.000、0.000),银屑病组患者血清IL-17、caspase-1、IL-18水平高于对照组。银屑病进展期患者血清IL-17、caspase-1、IL-18水平分别为(265.47±16.57)pg/mL、(137.56±8.93)pg/mL、(163.24±5.83)pg/mL,银屑病静止期患者血清IL-17、caspase-1、IL-18水平分别为(165.37±11.25)pg/mL、(68.73±5.46)pg/mL、(76.86±4.87)pg/mL,两组患者血清IL-17、caspase-1、IL-18水平比较差异均有统计学意义(P=0.000、0.000、0.000),银屑病进展期患者血清IL-17、caspase-1、IL-18水平高于静止期。银屑病患者血清IL-17和caspase-1、IL-18均呈正相关(r=0.673、0.742,P=0.000、0.000),血清caspase-1和IL-18呈正相关(r=0.587,P=0.000)。结论寻常型银屑病患者血清IL-17、caspase-1、IL-18水平升高,IL-17、caspase-1、IL-18在寻常型银屑病的发病中具有重要作用。

三磷酸腺苷敏感性钾通道开放剂对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8表达的影响

目的 研究三磷酸腺苷敏感性钾通道(KATP)开放剂对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)-8 表达的影响.方法 200只Wistar雄性大鼠随机分为假手术组、对照组、KATP开放剂预处理组(开放剂组)及KATP开放剂+阻断剂预处理组(阻断剂组).应用线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,应用原位末端标记法(TUNEL)、免疫组化染色、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测脑缺血再灌注后各组脑组织凋亡细胞数和caspase-8 mRNA及蛋白的表达.结果 (1)缺血再灌注12 h、24 h、48 h、72 h各时间点凋亡细胞数,开放剂组较对照组和阻断剂组显著减少(P＜0.05～0.01),阻断剂组与对照组间各时间点差异无统计学意义.(2)缺血再灌注12 h、24 h、48 h、72 h各时间点caspase-8蛋白表达,开放剂组显著低于对照组和阻断剂组(P＜0.05～0.01),阻断剂组与对照组间各时间点差异无统计学意义.(3)缺血再灌注各时间点caspase-8 mRNA表达,开放剂组均显著低于对照组和阻断剂组(均P＜0.01), 阻断剂组与对照组各时间点相比差异无统计学意义.结论 KATP开放剂能显著减少脑缺血再灌注后神经元凋亡和caspase-8 mRNA及蛋白的表达;KATP开放剂可能通过抑制死亡受体通路发挥脑保护作用.

基于NOD样受体蛋白3/半胱天冬酶-1信号通路探究槲寄生滴眼液对干眼症模型小鼠的治疗效果

目的基于NOD样受体蛋白3(NLRP3)/半胱天冬酶-1(Caspase-1)信号通路探究槲寄生滴眼液对干眼症模型小鼠的治疗效果。方法将干眼症模型小鼠(采用苯扎氯铵溶液滴眼造模)随机分为模型组(以生理盐水干预)、槲寄生滴眼液组(槲寄生滴眼液滴眼5μL,每天2次)、NLRP3/Caspase-1通路抑制剂(VX-765)组(腹腔注射50 mg/kg VX-765,每天1次)、槲寄生滴眼液+VX-765组(槲寄生滴眼液滴眼5μL,每天2次,腹腔注射50 mg/kg VX-765,每天1次),每组12只。另取12只健康小鼠作为对照组(以生理盐水干预)。各组均持续给药14 d。酚红棉线测定泪液分泌情况;苏木精-伊红染色观察结膜上皮和泪腺组织病理改变情况;酶联免疫吸附试验测定血清白细胞介素(IL)-18、IL-1β水平;荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别测定结膜上皮和泪腺组织NLRP3、Caspase-1 mRNA和蛋白表达。结果与对照组比较,模型组结膜上皮细胞排列紊乱,杯状细胞数量减少,固有层可见淋巴细胞浸润等病理损伤,泪腺组织呈现腺泡空泡样改变,结构不清晰,大小不均一,各小叶及腺泡间细胞排列紊乱等病理变化,泪液分泌量(酚红棉线被浸湿的长度,下同)[(2.66±0.42)mm比(6.14±1.09)mm,P<0.05]显著减少,血清IL-18[(53.16±6.95)pg/mL比(15.04±2.14)pg/mL,P<0.05]、IL-1β[(57.28±7.11)pg/mL比(24.51±3.06)pg/mL,P<0.05]、结膜上皮及泪腺组织NLRP3、Caspase-1 mRNA和蛋白[NLRP3 mRNA:(3.05±0.43)比(1.00±0.05),P<0.05;Caspase-1mRNA:(4.41±0.62)比(1.00±0.06),P<0.05;NLRP3蛋白:(1.33±0.21)比(0.17±0.03),P<0.05;Caspase-1蛋白:(1.51±0.26)比(0.20±0.04),P<0.05]表达显著升高。与模型组比较,槲寄生滴眼液组、VX-765组和槲寄生滴眼液+VX-765组结膜上皮和泪腺组织上述病理损伤减轻,泪液分泌量[(4.15±0.53)mm、(4.11±0.55)mm、(5.38±0.62)mm比(2.66±0.42)mm,P<0.05]显著增加,血清IL-18[(36.03±5.71)pg/mL、(35.92±5.66)pg/mL、(20.07±3.38)pg/mL比(53.16±6.95)pg/mL,P<0.05]、IL-1β[(40.85±5.04)pg/mL、(41.06±5.12)pg/mL、(28.08±4.57)pg/mL比(57.28±7.11)pg/mL,P<0.05]、结膜上皮和泪腺组织NLRP3、Caspase-1 mRNA和蛋白[NLRP3 mRNA:(2.11±0.32)、(2.09±0.29)、(1.37±0.22)比(3.05±0.43),P<0.05;Caspase-1 mRNA:(2.93±0.38)、(2.89±0.36)、(1.58±0.25)比(4.41±0.62),P<0.05;NLRP3蛋白:(0.60±0.11)、(0.59±0.09)、(0.19±0.04)比(1.33±0.21),P<0.05;Caspase-1蛋白:(0.72±0.12)、(0.74±0.11)、(0.23±0.05)比(1.51±0.26),P<0.05]表达显著降低。与槲寄生滴眼液组和VX-765组比较,槲寄生滴眼液+VX-765组结膜上皮和泪腺组织上述病理损伤进一步减轻,泪液分泌量[(5.38±0.62)mm比(4.15±0.53)mm、(4.11±0.55)mm,P<0.05]显著增加,血清IL-18[(20.07±3.38)pg/mL比(36.03±5.71)pg/mL、(35.92±5.66)pg/mL,P<0.05]、IL-1β[(28.08±4.57)pg/mL比(40.85±5.04)pg/mL、(41.06±5.12)pg/mL,P<0.05]、结膜上皮和泪腺组织NLRP3、Caspase-1 mRNA和蛋白[NLRP3 mRNA:(1.37±0.22)比(2.11±0.32)、(2.09±0.29),P<0.05;Caspase-1mRNA:(1.58±0.25)比(2.93±0.38)、(2.89±0.36),P<0.05;NLRP3蛋白:(0.19±0.04)比(0.60±0.11)、(0.59±0.09),P<0.05;Caspase-1蛋白:(0.23±0.05)比(0.72±0.12)、(0.74±0.11),P<0.05]表达显著降低。结论炎症,可能通过下调NLRP3/Caspase-1信号通路实现。

半胱天冬蛋白酶8基因多态性与先天性心脏病易感性的关联研究

目的研究中国汉族人群中半胱天冬蛋白酶8 rs3769818 C>T基因多态性与先天性心脏病发生的危险因素关系。方法运用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术对120例法洛四联征(TOF)患儿、124例大动脉转位(TGA),以及136例对照人群的半胱天冬蛋白酶8 rs3769818 C>T位点进行基因分型,计算各种基因型的先心病发病风险及其95%可信区间。结果半胱天冬蛋白酶8 rs3769818 C>T的三种基因型CC,CT,TT在TOF组、TGA组和对照组的频率分别为52.1%(CC),39.3%(CT),8.5%(TT);49.6%(CC),37.4%(CT),13.0%(TT)和52.6%(CC),40.0%(CT),7.4%(TT)。Logistic回归分析发现,与携带半胱天冬蛋白酶8 rs3769818 CC基因型的个体相比较,CT或TT基因型与TOF和TGA的发病风险没有显著的相关性。结论半胱天冬蛋白酶8 rs3769818C>T基因多态性可能不是先天性心脏病发生的危险因素。

吉非替尼诱导p27核转位并激活半胱天冬酶8促进NSCLC细胞凋亡的机制

目的探讨吉非替尼诱导的p27蛋白表达改变和核转位及半胱天冬酶(Caspase)8的激活对表皮生长因子受体(EGFR)突变的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞周期阻滞和细胞凋亡的影响及作用机制。方法选取存在19号外显子缺失突变的对吉非替尼敏感的NSCLC细胞系HCC827,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法和流式细胞术分别检测吉非替尼在不同浓度和时间下对细胞活性的影响。利用Western印迹检测p27蛋白和Caspase及其他相关蛋白的相对含量。通过免疫荧光法观察p27蛋白的亚细胞定位。采用蛋白免疫共沉淀验证p27蛋白和Caspase8之间的相互作用。结果吉非替尼浓度-时间依赖性促进了HCC827细胞凋亡。当吉非替尼干预18 h后,细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制因子p27蛋白表达开始出现显著升高(P<0.05),且p27蛋白在此过程中伴随从细胞核到细胞质的核转位现象,而促凋亡蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关x蛋白(Bax)和Bad及抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl/白血病-x基因长片段(Bcl-xl)在吉非替尼干预后表达并未发生显著改变。此外,细胞质中p27蛋白与Caspase8的降解中间体p43/p41结合从而抑制其自身细胞质向细胞核易位。结论推断吉非替尼通过调节p27蛋白的亚细胞定位及Caspase8之间的相互作用,从而达到促EGFR突变的NSCLC细胞凋亡的效果。

黄芪和红花对脑缺血再灌注后大鼠神经细胞凋亡和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8的影响

目的研究黄芪和红花对脑缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8的影响。方法采用局灶性脑缺血再灌注模型,分假手术组、模型组、黄芪加红花组、黄芪组和红花组。术后分为12h、24h和48h3个时间点,行神经功能评分;缺口末端标记法观察凋亡的情况;免疫组织化学观察缺血周围区神经细胞天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8表达强度。结果黄芪和红花均能改善大鼠脑缺血再灌注后的神经功能评分。缺血再灌注24h的凋亡阳性细胞数与模型组比较,各治疗组差异均有显著性(P<0.05);在治疗组中,黄芪加红花组与红花组和黄芪组凋亡阳性细胞数比较差异均有显著性(P<0.05)。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8阳性表达水平:缺血再灌注12h,黄芪组、黄芪加红花组与模型组比较,差异均有显著性(P<0.05);红花组与黄芪加红花组比较,差异均有显著性(P<0.05)。缺血再灌注24h和缺血再灌注48h,各组之间差异有显著性(P<0.05)。结论黄芪加红花可减轻大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡,其机制可能与下调凋亡通路中的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8的表达有关。

寻常性银屑病患者血清半胱天冬酶-1及IL-37,IL-18水平的检测

目的观察寻常性银屑病患者不同发病时期血清细胞因子半胱天冬酶-1(Caspase-1)及IL-37,IL-18的水平,分析其与疾病发展和转归的相关性。方法分别采集寻常性银屑病患者进行期(26例)、静止期(24例)和退行期(15例)以及30名健康对照者外周血,采用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测其血清中Caspase-1,IL-37及IL-18水平。结果各期寻常性银屑病患者血清Caspase-1水平均高于健康对照组血清Caspase-1水平;进行期寻常性银屑病患者血清中IL-37水平低于健康对照组血清中IL-37水平,静止期和退行期的寻常性银屑病患者血清中IL-37水平均高于健康对照组血清中IL-37水平;进行期和静止期寻常性银屑病组血清中IL-18水平高于健康对照组血清中IL-18水平,退行期寻常性银屑病患者血清中IL-18水平低于健康对照组(P<0.05),以上差异均有统计学意义(P均<0.05)。寻常性银屑病患者血清IL-37与IL-18的水平呈负相关(P<0.05),Caspase-1与IL-18的水平呈正相关(P<0.05)。结论 Caspase-1可能与IL-18共同参与银屑病的发病,IL-37可能作为一种抗炎细胞因子参与银屑病的发展和转归。

锰对人脐静脉内皮细胞及半胱天冬酶表达影响

目的探讨锰对人脐静脉内皮细胞系HUVEC-304细胞生长周期及半胱天冬酶-3（caspas-3）、半胱天冬酶-8（caspase-8）表达的影响。方法以100～800μmoml／L）的氯化锰分别处理HUVEC-304细胞24～72h后，四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）法检测EVC-304细胞的生长活性；流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡情况；蛋白印迹法（Western blot）检捌HUVEC-304细胞在，氯化锰半数抑制浓度（IC50）400μmol／L作用24h时caspase．8、caspase-3的表达。结果氯化锰可呈时间及剂量依赖性抑制HUVEC-304细胞的增殖和诱导细胞凋亡，抑制率为22．34％～90．94％，凋亡率为10．20％～98．73％。氯化锰24hIC50约为400μmol／L，在此浓度下。HUVEC-304细胞caspase-8、caspase-3表达显著增高。（P〈0．05）。结论氯化锰能够抑制HUVEC-304细胞的增殖。星明显的时效和量效关系。caspase-8、cas-pase-3表达增高在细胞增殖和凋亡中起重要的作用，可能是其作用机制之一。

早期激素性股骨头缺血性坏死模型的建立及半胱天冬酶3活性测定

背景:有研究表明骨细胞凋亡与激素性股骨头缺血性坏死的发病机制密切相关,而活化的半胱天冬酶3可作用于其他半胱天冬酶家族成员,使蛋白酶级联反应放大,最终导致细胞凋亡。但半胱天冬酶3参与的骨细胞凋亡与早期激素性股骨头缺血性坏死的相关研究则罕见报道。目的:采用大剂量激素联合强迫兔直立负重的方法建立早期激素性股骨头缺血性坏死模型并测定骨细胞半胱天冬酶3活性。方法:将4月龄新西兰大白兔随机分成模型组和对照组。模型组每周3次臀肌注射地塞米松,每日强迫兔直立1h,对照组注射等量生理盐水。分别于3,6,9和12周处死动物,取其双侧股骨头,光镜及电镜下观察组织病理学改变,应用对-硝基酰苯胺比色法测定骨细胞半胱天冬酶3活性。结果与结论:给药3周后,模型组光镜下可见脂肪细胞肥大和增多,骨髓间充质干细胞及造血干细胞数量相对减少;给药6周后,模型组空骨陷凹率均大于对照组(P<0.05);给药9周后,模型组出现骨小梁变细、断裂,电镜下见模型组部分骨细胞体积缩小,染色质浓集,核固缩和碎裂等凋亡特征。给药6周后,模型组骨细胞半胱天冬酶3活性高于对照组(P<0.05)。实验以此推论采用大剂量激素联合强迫兔直立负重可以诱导建立早期激素性股骨头缺血性坏死模型,半胱天冬酶3参与的骨细胞凋亡可能与早期激素性股骨头缺血性坏死发病过程有关。

三七总皂苷干预脊髓损伤大鼠诱导型一氧化氮合酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的变化

目的:观察三七总皂苷注射液对大鼠脊髓损伤后诱导型一氧化氮合酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的作用机制。方法:实验于2005-06/11在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。将64只SD大鼠数字表法随机分为损伤组和三七总皂苷组(n=32),2组按存活时间分为1,3,7,14d4个时间点,每个时间点8只。所有大鼠采用Allen’s法制备脊髓中度损伤模型(致伤能量为40g·cm),三七总皂苷组伤后30min腹腔注射50mg/L三七总皂苷100mg/kg,伤后2h及4h再次给予50mg/kg,以后1次/d,剂量200mg/kg,连用12d。损伤组相同时间点腹腔注射等体积生理盐水。2组均于预定时间点处死大鼠,取出伤段脊髓(以损伤处为中心,长约10mm),用苏木精-伊红染色观察损伤脊髓组织病理变化,免疫组化染色检测诱导型一氧化氮合酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞率。结果:64只大鼠全部进入结果分析。①苏木精-伊红染色光镜下发现脊髓组织病理学改变三七总皂苷组明显轻于损伤组。②诱导型一氧化氮合酶阳性细胞率:三七总皂苷组在伤后1,3,7,14d均低于损伤组[(21.38±3.69)%,(36.24±3.27)%,(30.56±2.89)%,(21.64±5.31)%;(39.48±3.78)%,(58.69±5.67)%,(68.97±5.34)%,(40.35±4.36)%,t=9.692,9.701,17.893,3.171,P<0.05]。③半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞率:三七总皂苷组在伤后1,3,7,14d均低于损伤组[(26.29±3.21)%,(35.42±2.25)%,(48.58±2.64)%,(23.72±3.26)%;(32.43±2.69)%,(46.18±3.07)%,(60.31±5.35)%,(31.98±4.80)%,t=4.147,7.996,5.561,11.231,P<0.05]。结论:三七总皂苷注射液能抑制脊髓损伤后诱导型一氧化氮合酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达,从而减轻细胞损伤和凋亡。

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对人肝癌细胞的凋亡及半胱氨酸天冬酶活性的影响

先前的研究表明,基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)具有诱导不同肿瘤细胞凋亡的作用.为了揭示其诱导肿瘤细胞凋亡的可能机理,从基因水平上探讨与凋亡有关的分子事件,本研究用不同浓度的rBTI体外作用于人肝癌细胞HepG2后,采用MTT比色法检测抑制剂对HepG2细胞的抑制率,用DNA凝胶电泳和细胞核的形态学观察检测HepG2细胞的凋亡.结果表明,rBTI在体外能够明显抑制HepG2细胞的增长,并诱导细胞凋亡.另外,细胞凋亡与Bcl-2/Bax mRNA水平有关.通过RT-PCR检测发现,细胞经过rBTI处理后,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA水平下调,促凋亡基因Bax mRNA有所上调,而对照GAPDH无变化.对HepG2细胞中Fas/Fas配体及半胱氨酸天冬酶(caspase)的研究证明,细胞经过rBTI处理后,对死亡受体Fas mRNA没有影响;rBTI可明显激活caspase-3和caspase-9酶活性,对caspase-8活性几乎无影响.上述结果表明,rBTI对HepG2细胞具有明显的诱导凋亡作用,其诱导细胞凋亡的机制与caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关,未涉及Fas/Fas配体途径.

凉血化瘀方抗肝细胞凋亡效应及对半胱天冬酶-3mRNA表达的影响

目的 研究半胱天冬酶-3(caspase-3)mRNA在内毒素肝损伤中的表达与肝细胞凋亡的关系,以及凉血化瘀方对其的影响。方法 腹腔注射内毒素脂多糖(Lipoplysaccharide,LPS)于D-氨基半乳糖(D-galactosamine, GalN)致敏的小鼠,造成暴发性肝衰竭(Fulminant Hepatic Failure, FHF)模型,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量分析caspase-3 mRNA表达,脱氧核苷酸转移酶介导的缺口原位末端标记技术(TUNEL法)、HE染色及透射电镜观察肝细胞凋亡情况,同时观察药物的影响作用。结果 造模3h肝组织caspase-3 mRNA明显表达,治疗组83%,模型组141%,6h二组表达水平接近。凋亡阳性细胞在6h表达最强,二组比较治疗组则明显减少(P<0.01)。结论 内毒素肝损伤中caspase-3 mRNA表达与肝细胞凋亡程度有相关关系,凉血化瘀方能延缓内毒素肝损伤肝细胞caspase-3 mRNA表达和抑制其凋亡效应。

瑞芬太尼对大鼠全脑缺血再灌注后神经元凋亡和半胱天冬酶-3表达的影响

目的观察瑞芬太尼对大鼠全脑缺血再灌注损伤后海马神经细胞凋亡和半胱天冬酶(Caspase)-3表达的影响。方法80只大鼠随机分为假手术(sham)、NS、REM2、REM6和REM20组,每组16只。NS、REM2、REM6和REM20组分别于缺血再灌注前静脉滴注0.9%氯化钠溶液及瑞芬太尼2、6、20μg.kg-1.min-1。采用双侧颈总动脉阻断+低血压法建立大鼠短暂性全脑缺血模型。于全脑缺血前30 min由靶控微量注射泵经股静脉注射瑞芬太尼,并于双侧颈总动脉阻断前及开放后10 min进行动脉血血气分析。再灌注后24 h,每组各取8只大鼠,取其新鲜海马组织,采用实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组Caspase-3 mRNA的表达。再灌注后72 h,取剩余大鼠,灌注取脑,制作脑组织切片,采用苏木精-伊红(H-E)染色和原位末端标记法(TUNEL法)观察各组大鼠海马退变的神经元数和凋亡细胞数,采用免疫组织化学法检测各组Caspase-3蛋白的表达。结果①H-E染色结果:sham组偶可见退变的锥体细胞,缺血再灌注72 h后,NS组及各瑞芬太尼预处理组海马退变的神经元数较sham组显著增加(P值均<0.05),REM6及REM20组海马退变的神经元数较NS组显著减少(P值均<0.05)。②TUNEL法检测结果:sham组未见TUNEL阳性细胞,缺血再灌注72 h后,NS组及各瑞芬太尼预处理组海马CAl区的凋亡锥体细胞数较sham组显著增加(P值均<0.05),REM6和REM20组海马CAl区的凋亡锥体细胞数较NS组显著降低(P值均<0.05)。③免疫组织化学法检测结果:sham组可见少量Caspase-3免疫阳性细胞,缺血再灌注72 h后,NS组及各瑞芬太尼预处理组海马区Caspase-3蛋白的免疫阳性细胞数较sham组显著增多(P值均<0.05),各瑞芬太尼预处理组Caspase-3蛋白的免疫阳性细胞数显著低于NS组(P值均<0.05),REM6和REM20组Caspase-3蛋白的免疫阳性细胞数显著低于REM2组(P值均<0.05)。④实时RT-PCR结果:sham组大鼠海马组织中Caspase-3 mRNA呈低水平表达,缺血再灌注24 h后,NS组及各瑞芬太尼处理组Caspase-3 mRNA的表达水平较sham组显著升高(P值均<0.05),REM6组Caspase-3 mRNA的表达较NS组显著降低(P<0.05)。结论瑞芬太尼预处理(以6μg.kg-1.min-1为佳)对全脑缺血再灌注后的神经元损伤具有一定的保护作用,其机制可能与抑制神经元凋亡及下调Caspase-3基因有关。