半胱氨酸丰富跨膜成骨蛋白调控因子1-骨形态发生蛋白4信号通路对血管紧张素Ⅱ诱导的心室肌细胞肥大的调控作用研究

目的探讨半胱氨酸丰富跨膜成骨蛋白调控因子1(Crim1)是否通过抑制骨形态发生蛋白4(BMP4)而调节血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心室肌细胞肥大。方法分离1 d龄SD大鼠乳鼠心室肌获心室肌细胞,按干预方式不同分九组:Ad-Null(腺病毒空载体)组、Ad-Null+AngⅡ、Ad-Null+AngⅡ+Nog(重组人头蛋白)组、Ad-Crim1(Crim1基因重组腺病毒载体)组、Ad-Crim1+AngⅡ组、Ad-Crim1+AngⅡ+Nog组、Ad-shCrim1(shRNA干扰介导沉默Crim1基因重组腺病毒载体)组、Ad-shCrim1+AngⅡ组和Ad-shCrim1+AngⅡ+Nog组。实时荧光定量逆转录PCR检测β-肌球蛋白重链(β-MHC)和BMP4的mRNA表达。Western免疫印迹法检测全细胞提取蛋白BMP4的表达。细胞经结晶紫染色后通过Image J软件测量细胞表面积。结果AngⅡ干预明显增加心室肌细胞β-MHC mRNA表达以及细胞面积,上调BMP4 mRNA/蛋白表达;Ad-Crim1和Nog干预明显抑制AngⅡ的上述效应。Ad-shCrim1干预沉默Crim1基因对心室肌细胞β-MHC mRNA表达,细胞面积及BMP4 mRNA/蛋白表达与AngⅡ干预效应相似,该效应为Nog干预明显抑制。结论Crim1通过下调BMP4的表达而抑制AngⅡ诱导的乳鼠心室肌细胞肥大。

AT1R-Crim1信号通路在乳鼠肥大心室肌细胞Kir2.1mRNA和蛋白表达调控中的作用

目的探讨血管紧张素Ⅱ受体1型(AT1R)—半胱氨酸丰富跨膜成骨蛋白调控因子(Crim1)信号通路在乳鼠肥大心室肌细胞编码内向整流钾电流离子通道的Kir2.1 mRNA和蛋白表达调控中的作用。方法分离1 d龄SD大鼠乳鼠心室获心室肌细胞,给予腺病毒空载体(Ad-Null)、Crim1基因重组腺病毒载体(Ad-Crim1)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和/或氯沙坦(Los)分组干预。实时荧光定量逆转录PCR检测肌球蛋白重链β(β-MHC)、Kir2.1和Crim1的mRNA表达。Western免疫印迹法检测全细胞提取蛋白Kir2.1和Crim1的表达,细胞结晶紫染色测量表面积。结果AngⅡ干预24 h明显增加心室肌细胞β-MHC的mRNA表达及细胞面积;下调Crim1和Kir2.1的mRNA和蛋白表达。Ad-Crim1和Los干预明显抑制AngⅡ干预的上述效应;Ad-Crim1联合Los较Ad-Crim1单独应用能更显著抑制AngⅡ刺激的上述效应。结论AT1R-Crim1信号通路参与乳鼠肥大心室肌细胞Kir2.1 mRNA和蛋白表达的调控。

Crim1过表达抑制肥大乳鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流改变

目的:探讨半胱氨酸丰富跨膜成骨蛋白调控因子(Crim1)对肥大乳鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)的调控作用.方法:将1d龄SD乳鼠心室肌细胞培养48 h后分组干预.重组腺病毒空载体(Ad-null)组给予Ad-null感染细胞32 h.重组腺病毒空载体+苯肾上腺素(Ad-null+PE)组予Ad-null感染细胞8h后,再予苯肾上腺素(PE)干预24 h.Crim1过表达重组腺病毒+苯肾上腺素(Ad-Crim1+PE)组给予携带Crim1基因的重组腺病毒感染细胞8h后,再予PE干预24 h.结晶紫染色培养细胞,ImageJ软件计算细胞表面积.全细胞膜片钳技术检测Ito,计算电流密度.结果:PE干预诱导心室肌细胞肥大,减小Ito电流密度;该效应可被过表达Crim1所抑制.结论:过表达Crim1可抑制PE诱导的心室肌细胞肥大及Ito改变.

Crim1在肥大心肌组织中的表达及AT1R对其表达的调控作用

目的:探讨半胱氨酸丰富跨膜成骨蛋白调控因子1(Crim1)在肥大心肌组织中的表达情况以及血管紧张素受体1型(AT1R)对其蛋白表达的调控作用。方法:将220~250g SD清洁级雄鼠随机分为4组:腹部假手术+等体积0.9%氯化钠溶液灌胃(对照组),腹主动脉缩窄术+等体积0.9%氯化钠溶液灌胃(AAC组),腹主动脉缩窄术+替米沙坦灌胃(3.57mg·kg^(-1)·d^(-1))(AAC+T组),腹部假手术+替米沙坦灌胃(3.57mg·kg^(-1)·d^(-1))(T组)。超声心动图测量各组大鼠左心室各室壁厚度、左心室内径,并计算左心室质量(校正值);HE染色检测各组大鼠心室肌细胞横截面积,Western blot、Crim组织化学检测各组大鼠心室肌细胞Crim1蛋白的表达。结果:腹主动脉缩窄术诱导的大鼠肥大心室肌中的Crim1蛋白表达下调,而替米沙坦可抑制此下调过程。结论:肥大心肌组织中Crim1蛋白表达下调,AT1R信号通路可能介导了肥大心肌组织中Crim1蛋白表达的调控。

CRIM1在肝细胞癌中的表达及其与上皮-间质转化关系的初步研究

目的 探讨半胱氨酸丰富跨膜成骨蛋白调控因子1(CRIM1)在肝细胞癌(简称肝癌)中的表达及临床意义,初步探讨CRIM1表达水平与上皮细胞-间质转化(EMT)之间的关联性。方法 回顾性分析2013年1月—2017年12月扬州大学附属苏北人民医院收治的114 例肝癌手术患者的临床病理资料,收集患者的术后肝癌组织和对应癌旁组织病理学标本,石蜡切片包埋,并行免疫印迹试验(Western blotting)及免疫组织化学染色检测,观察指标:(1)肝癌组织和癌旁组织中CRIM1蛋白及EMT相关蛋白(E-钙黏蛋白、波形蛋白)表达情况;(2)肝癌组织中CRIM1蛋白表达与患者临床病理因素的关系。运用Western blotting检测肝癌患者癌组织、癌旁组织中CRIM1及EMT相关蛋白(E-钙黏蛋白、波形蛋白)表达水平情况,采用t检验方法进行灰度值分析;采用免疫组化检测肝癌组织和癌旁组织中CRIM1蛋白表达情况,根据组化评分将其分为高表达组、低表达组,并用χ2检验和Spearman相关性分析方法分析CRIM1蛋白的不同表达与患者临床病理因素的关系。最后通过Kaplan Meier Plotter数据库分析CRIM1与肝癌患者生存率之间的关联性。 结果 Western blotting显示肝癌组织和癌旁组织中CRIM1蛋白表达灰度值分别为0.15±0.03、0.80±0.04,E-钙黏蛋白表达水平分别为0.20±0.05、0.56±0.06,两者在癌旁组织中表达水平显著高于癌组织(t=14.21、4.69,P<0.05),而波形蛋白在肝癌组织和癌旁组织中表达水平分别为0.74±0.08、0.45±0.06,在癌组织中表达水平显著高于癌旁组织(t=2.87,P<0.05)。免疫组化进一步验证肝癌组织及癌旁组织中CRIM1表达水平,114 例患者中肝癌组织中,46 例CRIM1蛋白高表达,68 例CRIM1蛋白低表达,CRIM1的表达与患者甲胎蛋白水平、肿瘤大小、有无症状具有关联(r=-0.43、-0.34、-0.24, χ2=9.38、5.25、8.12,P<0.05)。Kaplan Meier Plotter数据库分析表明,CRIM1高表达与低表达两者生存情况差异有统计学意义(P=0.04)。结论 在肝癌中CRIM1的表达与肿瘤EMT过程呈负关联,CRIM1有望成为判断肝癌预后的潜在分子标志物。