N-乙酰半胱氨酸对热胁迫香菇菌丝活性氧代谢及糖酵解的影响

为探究外源N-乙酰半胱氨酸(NAC)对热胁迫香菇(Lentinula edodes)菌丝活性氧代谢和糖酵解的影响,本研究以耐热性较弱菌株为供试菌株,设置不同浓度的外源NAC添加至培养基中,于37℃热胁迫处理下筛选出最佳添加浓度。采用此浓度,于37℃下进行热胁迫(胁迫0、6、12、24 h),以及热胁迫后恢复生长(胁迫24 h后于25℃下恢复培养6 h)处理,测定菌丝活性氧代谢和糖酵解相关指标。结果表明,0.1 mmol·L^(-1)为最佳添加浓度。在热胁迫中,与未添加NAC(对照)相比,添加NAC处理超氧阴离子、过氧化氢、蛋白质羰基、硫代巴比妥酸反应物含量的峰值分别显著降低40.94%、41.97%、53.21%、47.62%;超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶、己糖激酶、丙酮酸激酶活性和还原型谷胱甘肽含量的峰值分别显著提高19.21%、43.98%、12.36%、21.95%、25.42%、54.41%、31.93%。同时,在热胁迫恢复生长中,添加NAC处理的菌丝活性氧物质和氧化损伤产物含量仍显著低于对照,而超氧化物歧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶、己糖激酶、丙酮酸激酶活性以及还原型谷胱甘肽含量仍显著高于对照。NAC有效维持了胁迫中菌丝活性氧稳态,使抗氧化酶活性和还原型谷胱甘肽含量保持在较高水平,并减缓氧化损伤程度和进程,加快菌丝糖酵解途径。多因素方差分析表明,NAC主要对还原型谷胱甘肽、硫代巴比妥酸反应物、超氧阴离子含量和己糖激酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶活性等指标具有显著效应。本研究结果为外源NAC在热胁迫环境下食用菌中的应用推广提供了新思路。

胱硫氨酸β-合成酶在食管胃结合部腺癌中的表达及其临床意义

目的 检测胱硫氨酸β-合成酶(CBS)在食管胃结合部腺癌(AEG)中的表达,探讨CBS表达与肿瘤血管新生、临床病理特征及预后的关系。方法 选取经手术切除的243例AEG患者的蜡块标本制作病理芯片,采用免疫组织化学法检测癌组织及配对癌旁正常组织中CBS、血管内皮细胞生长因子(VEGF)及微血管密度(MVD)的表达情况,分析CBS表达水平与VEGF及肿瘤MVD的相关性。探讨CBS表达水平与AEG患者的临床病理特征及预后的关系。结果 CBS在AEG患者的癌组织和配对癌旁正常组织中的阳性表达率分别为66.67%(162/243)和30.45%(74/243),两组比较差异有统计学意义(P<0.001)。CBS表达水平与T分期、淋巴结转移、吸烟史、VEGF表达及MVD均有关(P<0.05),而与患者的年龄、性别、分化程度、TNM分期及饮酒史无关(P>0.05)。CBS低表达患者的中位无病生存时间(DFS)为63个月,显著长于CBS高表达患者的50个月,差异有统计学意义(P=0.0039)。Cox多因素回归分析显示,CBS表达(HR=1.827,95%CI:1.146~2.912,P=0.011)、VEGF表达(HR=2.684,95%CI:1.637~4.401,P<0.001)、MVD(HR=4.064,95%CI:2.419~6.829,P<0.001)及TNM分期(HR=2.354,95%CI:1.523~3.638,P<0.001)是影响AEG患者DFS的独立因素。结论 CBS高表达可能与肿瘤新生血管相关,是AEG预后的不良因素之一,在AEG的诊治中具有潜在应用价值。

高血压患者合并脑梗死的影响因素分析及同型半胱氨酸、D-二聚体、降钙素原在高血压合并脑梗死中的诊断效能

目的探讨高血压患者合并脑梗死的影响因素分析及同型半胱氨酸(Hcy)、D-二聚体(D-D)、降钙素原(PCT)对高血压合并脑梗死的诊断效能,为临床诊疗提供参考。方法选取2023年3月至2024年3月商河县人民医院收治的106例高血压患者的临床资料,进行回顾性分析。根据是否合并脑梗死分为未合并组(47例)与合并组(59例)。比较两组患者临床资料,采用多因素Logistic回归分析影响高血压患者合并脑梗死的独立危险因素,绘制受试者操作特征(ROC)曲线分析Hcy、D-D、PCT各项单一检测及联合检测在高血压合并脑梗死中的诊断效能。结果两组患者年龄、性别、体质量、饮酒史、吸烟史、BMI、高血压病程、入院时舒张压、入院时收缩压比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。合并组患者TC、LDL-C、Hcy、D-D、PCT水平均高于未合并组(均P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示:Hcy水平高、D-D水平高、PCT水平高均为影响高血压患者合并脑梗死的独立危险因素(均P<0.05)。ROC曲线分析结果显示:Hcy、D-D、PCT联合检测高血压合并脑梗死的曲线下面积(AUC)为0.902、敏感度为0.896、特异度为0.823,均高于各项单一检测(均P<0.05)。结论Hcy水平高、D-D水平高、PCT水平高均为影响高血压患者合并脑梗死的独立危险因素,且Hcy、D-D、PCT联合检测对高血压患者合并脑梗死的诊断价值较高,能为临床早期诊断和干预提供参考。

冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血清同型半胱氨酸、超敏C反应蛋白水平与冠状动脉病变程度的关系研究

目的 探讨冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)患者血清同型半胱氨酸(Hcy)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平与冠状动脉(简称冠脉)病变程度的关系。方法 选取2020年5月至2024年5月于盐城市第一人民医院治疗的104例冠心病患者为冠心病组,另选取同期于盐城市第一人民医院进行体检的50例健康体检者为对照组,进行回顾性分析。采用冠脉造影评估患者冠脉狭窄程度,并分为轻度组(34例)、中度组(37例)和重度组(33例)。比较冠心病组与对照组研究对象及不同冠脉狭窄程度患者资料;分析氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)、Hcy、hs-CRP水平与冠心病患者冠脉狭窄程度的相关性;采用受试者操作特征(ROC)曲线分析NT-proBNP、Hcy、hs-CRP水平评估冠心病患者重度冠脉狭窄的价值。结果 冠心病组研究对象NT-proBNP、Hcy、hs-CRP水平均高于对照组(均P<0.05)。重度组患者NT-proBNP、Hcy、hs-CRP水平均高于中度组、轻度组,中度组均高于轻度组(均P<0.05)。Spearman秩相关分析结果显示,NT-proBNP、Hcy、hs-CRP水平与冠心病患者冠脉狭窄程度呈正相关(均P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,NT-proBNP、Hcy、hs-CRP单独及联合评估冠心病患者重度冠脉狭窄的曲线下面积(AUC)分别为0.854、0.863、0.823、0.942,灵敏度分别为0.788、0.758、0.758、0.909(均P<0.05)。结论 随着冠心病患者冠脉狭窄程度加重,NT-proBNP、Hcy、hs-CRP水平升高,上述指标可用于诊断冠心病冠脉狭窄程度。

嗜酸氧化亚铁硫杆菌半胱氨酸合成酶的表达、纯化及其性质鉴定

半胱氨酸合成酶是半胱氨酸合成反应的关键限速酶,催化了半胱氨酸合成的最后一个步骤。以A.ferro-oxidans ATCC 23270基因组为模板,通过PCR扩增得到编码半胱氨酸合成酶(cysM)的基因,与原核表达载体PLM 1构建重组体,转入大肠杆菌DH5α中,测序正确后,加IPTG诱导表达,用一步亲和层析法纯化出了浓度和纯度都较高的半胱氨酸合成酶。由蛋白颜色和紫外分析,确定是以PLP辅基作为活性中心。表达产物进行SDS-PAGE分析,证实分子量为32 kD。

亚甲基四氢叶酸还原酶基因及甲硫氨酸合成酶基因多态性与口服叶酸治疗高同型半胱氨酸血症疗效的关系研究

目的分析亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶基因(MTR)多态性与口服叶酸治疗高同型半胱氨酸血症(HHcy)疗效的关系及基因与环境在治疗效果中的交互作用。方法选取2014年6—9月于郑州大学第五附属医院神经内科检查血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平的住院HHcy患者515例为研究对象。常规治疗基础上给予口服叶酸(5 mg/d)治疗90 d。治疗中期(叶酸补充45 d)行第1次电话随访,治疗结束(叶酸补充90 d)行第2次电话随访,督促患者遵循医嘱服药,并在治疗结束后到医院复查血浆Hcy水平。按照复查血浆Hcy水平将患者分为失败组(Hcy≥15.0μmol/L)和成功组(Hcy<15.0μmol/L)。收集患者的基线资料,选取MTHFR上2个单核苷酸多态性(SNP)位点和MTR上1个SNP位点,分别为:rs1801133、rs1801131和rs1805087;采用Sequenom公司的时间飞行质谱生物芯片系统(Mass Array系统)检测基因分型和等位基因,采用多因素降维法(MDR)分析基因-环境交互作用。结果随访结束后,剔除服药依从性差或者失访患者131例,剔除两次服药依从性均一般的患者125例,剩余259例。其中失败组115例,成功组144例。失败组患者糖尿病病史发生率、高血压病史发生率、冠心病病史发生率、基线血浆Hcy水平均高于成功组(P<0.05)。成功组3个SNP位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(rs1801133:χ2=0.11,P=0.170;rs1801131:χ2=0.00,P=1.000;rs1805087:χ2=0.01,P=0.860)。单因素非条件Logistic回归分析结果显示,rs1801133位点的TT基因型、T等位基因,rs1801131位点的AC基因型、AC+CC基因型、C等位基因与叶酸治疗HHcy疗效有回归关系(P<0.05)。MDR软件结果显示,最优模型为高血压病史、冠心病病史和rs1801133的三因素交互模型(P<0.05)。结论 MTHFR rs1801133位点的TT基因型和等位基因T可增加叶酸治疗HHcy失败的风险;rs1801131位点的AC基因型、AC+CC基因型和等位基因C可降低叶酸治疗HHcy失败的风险。MTR rs1805087位点基因型及等位基因与叶酸治疗HHcy疗效无回归关系。高血压病史、冠心病病史、rs1801133位点对叶酸治疗HHcy的疗效具有交互作用。

冠心病并高同型半胱氨酸血症患者甲硫氨酸合成酶基因突变的研究

目的:研究中国人冠心病并高同型半胱氨酸血症患者甲硫氨酸合成酶(MS)基因突变的情况。方法:应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)以及DNA测序技术,检测60例患者MS基因中与结构和功能密切相关的10个外显子的点突变情况。结果:除已知的31外显子区3个SNP位点比较常见外,还发现了1个新的点突变,3 869位为A/G杂合子(A→G的错义突变可使1 195位氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸),此患者的血浆同型半胱氨酸血水平明显高于正常,为30.93μmol.L-1。此外发现32内含子1个新的G/T多态性。结论:MS某种基因突变可能是影响MS酶功能及高同型半胱氨酸血症的原因之一。

条斑紫菜半胱氨酸合成酶基因的电子克隆与分析

从网络共享的条斑紫菜(Porph yrayezoensis Ueda)表达序列标签(expressed sequencetag,EST)数据库检索出与拟南芥(Arabidopsis thaliana)半胱氨酸合成酶(cysteine synthase,CSase)基因高度相似的EST序列,构建EST叠连群(contig),并依据contig设计引物。提取条斑紫菜叶状体总RNA,采用RT-PCR方法,扩增得到了条斑紫菜半胱氨酸合成酶基因(PyCSase-B)的cDNA序列(GenBank accession:FJ232911)。该cDNA序列含有长1152nt的完整开放阅读框,编码产物(PyCSase-B)的分子量39.3kD,长383AA。PyCSase-B的N端前60个氨基酸残基构成了叶绿体转运肽序列,成熟的PyCSase-B定位在叶绿体中。PyCSase-B与紫红紫菜(P.purpurea)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、拟南芥和水稻(Oryza sativa)的序列一致性分别为94%、69%、64%和65%,进化树显示PyCSase-B在进化上处在细菌和高等植物之间。PyCSase-B含有与5'-磷酸吡哆醛(Pyridoxal 5'-phosphate)和O-乙酰丝氨酸(O-acetylserine)结合的保守氨基酸残基和序列,含有将硫转移到半胱氨酸的保守残基;成熟PyCSase-B单体的三维结构与拟南芥CSase相似,由2个α/β结构域组成。PyCSase-B的成功克隆与生物信息学分析有助于进一步研究其在条斑紫菜抗逆调控中的作用。

西伯利亚蓼半胱氨酸合成酶基因的克隆与表达

半胱氨酸合成酶是植物半胱氨酸合成反应的关键限速酶。文中应用RACE技术从西伯利亚蓼中成功克隆了半胱氨酸合成酶基因(GenBank登录号:EU597481),命名为PcCSase1,该基因全长cDNA为1260bp,编码382个氨基酸。经生物信息学分析,初步确定PcCSase1的N端前16个氨基酸为信号肽,并引导PcCSase1蛋白定位于胞质,为胞质型半胱氨酸合成酶。同源序列分析表明,此蛋白与其他植物半胱氨酸合成酶成熟蛋白序列高度保守,氨基酸相似性达到90%左右。荧光定量RT-PCR分析表明,PcCSase1在西伯利亚蓼的叶、茎和地下茎中均有表达,叶中表达最高,茎和地下茎次之,在3%NaHCO3胁迫过程中,该基因在叶、茎和地下茎中均在第2d表达量最高。将PcCSase1转入酿酒酵母INVSc1,结果显示培养基中半胱氨酸和菌体中谷胱甘肽含量均有显著增加,在10%NaHCO3和5mol/LNaCl胁迫下,转基因INVSc1-pYES2-PcCSase1菌株的存活率明显高于对照INVSc1-pYES2,证明PcCSase1基因具有耐高盐的作用。

水稻谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的结构和表达分析

利用该实验室T-DNA标签的编号为L395的水稻突变体,克隆了一个编码水稻谷胱苷肽(GSH)合成途径中关键酶即谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)的基因,将其命名为OsGCS(Genbank accession No.AJ508915)。该基因位于水稻第五染色体上,OsGCS基因含有15个外显子和14个内含子,编码492个氨基酸。该基因与拟南芥的GCS基因相比较,编码区域同源性较高,而启动子区域的序列没有显著的相似性。通过RT-PCR的方法确定OsGCS基因的转录起始位点可能位于翻译起始位点(ATG)上游211 bp处。在L395突变体中,T-DNA是单拷贝形式插入在OsGCS基因的第二内含子和外显子连接处,并且造成了3个碱基的缺失.在重金属耐受性、OsGCS基因表达以及体内GSH含量方面突变体L395和对照中花11之间没有明显的差别。

胱硫醚β-合成酶基因多态性及血浆同型半胱氨酸与新疆哈萨克族原发性高血压的关系

目的：探讨胱硫醚β-合成酶（Cystathione beta synthase，CBS）基因 T833C、G919A、844ins68多态性及血浆同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）水平与新疆哈萨克族原发性高血压（Essential Hypertension，EH）的关系。方法选择新疆哈萨克族 EH 患者118例（EH 组）和住院体检者108例（对照组），使用扩增阻滞实变体系法检测 CBS T833C、G919A、844ins68多态性，并采用酶标免疫吸附检测法检测血浆 Hcy 水平，化学发光法检测血浆叶酸、维生素 B12（VitB12）水平。结果EH 组血浆 Hcy 水平均高于对照组（P ＜0．05）。CBS T833C、G919A 纯合型、杂合型血浆 Hcy 水平高于野生型，且差异有统计学意义（P ＜0．05）。EH 组 CBS 基因第833位点 C 等位基因频率、第919位点 A 等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义（CBS 833位点 C 等位基因：χ^2＝5．917，P ＝0．015；CBS 919位点 A 等位基因：χ^2＝5．917，P ＝0．020）。通过 Logistic 多元回归去除混杂因素后显示：年龄（OR＝1．120，P ＝0．000，95％ CI 1．077～1．165）、肥胖（OR ＝1．086，P ＝0．040，95％ CI 1．004～1．174）、高同型半胱氨酸血症（OR ＝1．099，P ＝0．039，95％ CI 1．005～1．203）是新疆哈萨克族 EH 的独立危险因素。结论血浆 Hcy水平与新疆哈萨克族 EH 相关。CBS T833C、G919A、844ins68基因多态性可能与新疆哈萨克族 EH 无关。

同型半胱氨酸及胱硫醚β-合成酶基因多态性与2型糖尿病合并冠心病的关系

目的探讨我国北方汉族糖尿病(DM)合并冠心病(CHD)者同型半胱氨酸水平(Hcy)及Hcy代谢相关酶胱硫醚β-合成酶(CBS)的844ins68的基因多态性特点。方法检测104例2型DM合并CHD患者(DM合并CHD)、127例2型DM患者、61例CHD患者和91名健康对照者的Hcy、叶酸、维生素B12、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白A-I(apo A-I)、载脂蛋白B(apo B)浓度。应用聚合酶链反应(PCR)分析CBS 844ins68基因多态性。结果DM合并CHD组Hcy水平明显高于DM组和对照组,叶酸、维生素B12水平明显低于DM组及对照组(P<0.01)。DM合并CHD组与CHD组Hcy、叶酸、维生素B12水平差异无统计学意义(P>0.05)。DM组与对照组之间Hcy、叶酸、维生素B12水平差异无统计学意义(P>0.05)。4组CBS 844ins68的基因型及等位基因频率差异均无统计学意义(P>0.05)。Lo-gistic回归分析显示高Hcy水平、年龄、TC是CHD发生的独立危险因素,OR值[95%可信区间(CI)]分别为2.117(1.081～4.145)、1.105(1.070～1.142),1.023(1.005～1.042)(P均<0.05)。CBS 844ins68的OR值(95%CI)为1.254(0.229～6.867)(P>0.05)。结论高Hcy水平是我国北方汉族人2型DM合并CHD发生的独立危险因素。CBS 844ins68基因多态性不是2型DM合并CHD的危险因素。

同型半胱氨酸及胱硫醚β合成酶T833C多态性与新疆哈萨克族原发性高血压的相关性

目的：探讨血浆同型半胱氨酸（ Hcy ）及胱硫醚β合成酶（ CBS ）基因 T833C 多态性与新疆哈族原发性高血压（ EH ）的相关性。方法：选取哈族 EH 患者239例（ EH 组）和206例血压正常者（对照组）为研究对象，自动生化仪检测受试对象血浆 Hcy 水平及生化指标，扩增阻碍突变系统（ ARMS ）检测两组 CBS T833C 多态性，观察 TT、TC 和 CC 基因型以及 T、C 等位基因频率在 EH 组和对照组中的分布。结果：哈族EH 患者血浆 Hcy 水平高于对照组，且 TC 基因型个体血浆 Hcy 水平高于 TT 基因型个体，差异有统计学意义（P ＜0．05）；哈族 EH 组 C 等位基因高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0．05）；哈族组携带 C 等位基因的 TC 基因型个体患 EH 的风险是 TT 基因型的2．39倍（OR ＝2．39，95％CI：1．125～5．076，P ＝0．02）。结论： Hcy 水平升高可能是哈族 EH 的危险因素之一， CBS T833C 基因多态性与哈族 EH 存在相关性。

含氨基乙烯半胱氨酸核糖体肽的生物合成与化学合成

核糖体肽是一类拥有化学结构和生物活性多样性的多肽天然产物家族,在药物开发方面具有巨大的发展潜力。氨基乙烯半胱氨酸(AviCys)是部分核糖体肽类天然产物中存在的一种特殊C末端交联结构单元。含有AviCys单元的核糖体肽类天然环肽往往具有优良的抗菌或抗肿瘤活性,且AviCys大环结构对其生物活性至关重要。本文围绕此类天然环肽的生物合成和化学合成进行了总结:①羊毛硫肽、lipolanthines、linaridins和thioamitides四类核糖体肽天然产物中AviCys结构单元的生物合成研究进展,主要包括C末端半胱氨酸的氧化脱羧反应,丝氨酸/苏氨酸或半胱氨酸脱水或脱硫反应,以及AviCys环化反应;②针对含AviCys结构单元环肽的化学合成方法,包括自由基硫醇-炔偶联、氧化脱羧/脱羰、酰胺与缩醛缩合等。本综述同时对相关研究中存在的若干挑战和尚待解决的问题进行了梳理和总结,包括生物合成过程中尚未得到深入解析的环化步骤、化学合成中尚未解决的立体选择性和化学兼容性等。综上,对含AviCys结构单元天然环肽的生物合成途径全面解析及化学合成方法的开发,有望为此类生物功能环肽及其衍生物的制备与生物工程改造奠定基础,推动该类功能环肽在生命科学和药物科学领域的应用。

丰白散对COPD模型大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶及超氧化物歧化酶的影响

目的通过观察丰白散对慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)与超氧化物歧化酶(SOD)的影响,探讨丰白散治疗COPD的作用机制。方法采用烟熏加气管内滴加脂多糖方法复制COPD模型,用苏木素-伊红(HE)染色评估各组大鼠肺组织病理改变,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测γ-GCSmRNA表达水平,用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力。结果模型组、丰白散组、沐舒坦组大鼠肺组织出现了符合人COPD的病理改变,COPD模型复制成功;与正常组相比,模型组大鼠肺组织γ-GCSmRNA表达水平、SOD活力均明显降低,两者比较差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,丰白散组肺组织γ-GCSmRNA表达水平、SOD活力均增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论丰白散能增强COPD模型大鼠γ-GCS表达及SOD活力,纠正氧化/抗氧化失衡,增强抗氧化能力,这可能是丰白散治疗慢性阻塞性肺疾病的作用机制之一。

血浆同型半胱氨酸及胱硫醚β合成酶多态性与脑血栓形成

目的探讨血浆同型半胱氨酸(Hcy)及胱硫醚β合成酶(CBS)基因多态性与脑血栓形成的关系.方法应用高效液相色谱-荧光法及扩增阻滞突变体系法测定87例急性脑血栓形成患者和80例对照者血浆Hcv浓度和CBS基因型.结果病例组平均空腹血浆Hcy浓度15.28 μmol/L(95%CI为14.37～16.19)较对照组11.32μmol/L(95%CI?0.47～12.16)高(P＜0.001).CBS两突变位点对血浆Hcy浓度的影响不一致.病例组和对照组基因型分布、纯合子频率和等位基因频率差异均无统计学意义.结论高Hcy血症与脑血栓形成发病有关.

白三烯诱导人呼吸道上皮细胞氧化应激及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的作用研究

目的研究白三烯诱导人呼吸道上皮细胞内谷胱甘肽氧化还原状态变化及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的作用。方法将人气道上皮细胞分为对照组和暴露组。暴露组的人气道上皮细胞暴露于白三烯2、4、6、12 h。检测对照组及暴露组在2、4、6、12 h相应指标。测定气道上皮细胞内谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量;双酶法测定γ-GCS活性;RT-PCR检测气道上皮细胞中γ-GCS-mRNA表达;Western-blot检测气道上皮细胞核和细胞质中γ-GCS蛋白表达;细胞免疫荧光法检测气道上皮细胞γ-GCS蛋白表达。结果暴露组细胞2、4、6、12 h的GSH含量、GSH/GSSG比值先减少后逐渐增加,4 h最低,6 h达最高,12 h恢复正常;而GSSG含量则呈现相反趋势,与对照组之间差异有统计学意义。暴露组细胞2、4、6 h,γ-GCS活性增强,与对照组比较差异有统计学意义。细胞免疫荧光法检测气道上皮细胞γ-GCS蛋白阳性信号主要分布在胞质中,暴露组呈强阳性表达,而对照组表达较弱,暴露组2、4、6 h时与对照组比较,差异有统计学意义。Western-blot检测结果相似。RT-PCR检测气道上皮细胞中γ-GCS-mRNA表达,暴露组2、4、6 h时较对照组增加,差异有统计学意义。结论白三烯诱导氧化应激影响呼吸道上皮细胞谷胱甘肽氧化还原状态,而呼吸道上皮细胞通过提高γ-GCS活性对抗氧化应激,保持氧化还原稳定的状态。

人γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因E-box元件功能初步分析

目的:探讨人支气管上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)基因上游调控序列E-box元件的功能。方法:利用PCR法克隆人GCLC基因上游调控序列,PCR重叠延伸法对2个E-box元件分别和同时进行定点突变。扩增获得的突变体片段克隆入PMD18-T载体,DNA测序鉴定后,亚克隆入野生型GCLC-Luc荧光素酶报道载体。将3个突变体质粒和野生型质粒转染人肺泡上皮细胞A549和人支气管上皮细胞16HBE,检测转染后细胞荧光素酶活性值。结果:测序结果证实,成功将E-box1CACGGG突变为AGCGGG;E-box2CACGTG突变为CACGGA。GCLC-Luc、GCLC-mEbox1-Luc(突变E-box1)、GCLC-mEbox2-Luc(突变E-box2)、GCLC-mEbox12-Luc(突变E-box1和E-box2)转染A549细胞后荧光素酶活性值分别为(5197852±132206)U、(5455692±127431)U、(5315722±244197)U、(5174303±183179)U,转染16HBE细胞后荧光素酶活性值分别为(141157±18907)U、(126454±23724)U、(137315±22179)U、(132441±28970)U。经过统计学分析,各组荧光酶活性没有显著差别,均P>0.05。结论:E-box元件不参与基础状态下A549细胞和16HBE细胞GCLC基因转录调控。

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、转化生长因子β1在吸烟大鼠肺组织中的表达

目的观察不同吸烟时间大鼠支气管上皮细胞、肺泡巨噬细胞和肺组织中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA及其蛋白的表达水平以及二者的相关性,探讨TGF-β1在吸烟所致慢性阻塞性肺疾病(COPD)氧化/抗氧化失衡中的作用。方法自制大鼠实验性被动吸烟装置,建立吸烟引起COPD的动物模型,将40只大鼠随机分为不吸烟组、吸烟1月组、吸烟2月组、吸烟3月组,每组各10只。分别采用免疫组织化学法、免疫细胞化学法和原位杂交半定量技术检测支气管上皮细胞及肺泡巨噬细胞中γ-GCSh(重链亚单位)和TGF-β1mRNA及其蛋白的表达水平。逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测肺组织匀浆中γ-GCSh和TGF-β1mRNA的表达水平。结果吸烟3月组大鼠出现了肺气肿的病理改变。①吸烟1月、2月和3月组大鼠支气管上皮细胞γ-GCSh和TGF-β1mRNA及蛋白表达水平、肺泡巨噬细胞γ-GCSh和TGF-β1蛋白表达水平明显高于不吸烟组(均P<0.01)。②吸烟1月、2月和3月组大鼠肺组织匀浆中γ-GC-Sh和TGF-β1mRNA表达水平明显高于不吸烟组(均P<0.05)。③吸烟1月组和吸烟3月组大鼠支气管上皮细胞γ-GCShmRNA及其蛋白的表达水平与TGF-β1表达水平呈直线正相关,肺泡巨噬细胞γ-GCSh蛋白表达水平与TGF-β1表达呈直线正相关;吸烟3月组肺组织匀浆中γ-GCShmRNA表达水平与TGF-β1表达呈直线正相关。结论随着吸烟时间的延长,支气管肺组织中γ-GCS和TGF-β1的mRNA及其蛋白表达水平逐渐增高,并且二者呈正相关;提示TGF-β1在吸烟所致COPD氧化/抗氧化失衡中可能发挥一定的作用。

同型半胱氨酸和蛋氨酸合成酶还原酶A66G基因多态性与Alzheimer病的关系

目的探讨同型半胱氨酸(H cy)和蛋氨酸合成酶还原酶(M SR)A66G基因多态性与Alzheim er病的关系。方法运用多聚酶链反应限制性内切酶片段长度多态性技术(PCR-RFLP)和荧光偏振法(FPIA)检测66例Alzheim er病及143例正常人M SR A66G基因多态性和血浆总H cy水平。结果Alzheim er病组M SR A66G基因型频率(%)分别为39.39、59.09和1.52,对照组分别为37.76、59.44和2.80,M SR A66G各种基因型频率在患者组与正常对照组之间的差异无显著性(P>005)。Alzheim er病病例组与对照组血浆H cy分别为(14.72±6.2)μm ol/L和(10.9±2.4)μm ol/L,两者差异有显著差异(P<0.05)。Alzheim er病患者血浆总H cy水平显著高于正常组。结论M SRA66G多态性与Alzheim er病无明显相关,高同型半胱氨酸血症与Alzheim er病发生有一定关系。