Endo180半胱氨酸富集区与I型胶原蛋白C末端分子的体外相互作用

I型胶原蛋白（type I collagen）是由2条α1链和1条α2链构成的纤维状异源三聚体.它是构成细胞外基质最主要的成分.I型胶原蛋白和内吞胶原蛋白受体Endo180（Endocytic 180）之间的相互作用在细胞基质的粘附和降解过程中起着关键性作用.但内吞胶原蛋白受体Endo180与胶原蛋白的结合区域尚未有相关的报道.本研究在体外通过酶联免疫吸附、蛋白免疫沉淀和Western印迹等多种定量分析实验发现,用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AP）标记I型胶原蛋白C末端（氨基酸1151~1464）后形成的分泌型三聚体融合蛋白AP-Coll-S,可与用抗体恒定区（antibody constant fragment,Fc）标记的Endo180的半胱氨酸富集区（CysR）结合.从而表明,AP-Coll-S和CysR-Fc之间存在相互作用.本研究结果为进一步研究胶原蛋白和其受体Endo180的分子间相互作用提供新依据.

缺失半胱氨酸富集区的HIV-1 HXB2株Tat蛋白在大肠杆菌中的高效表达及免疫原性分析

目的删除人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）HXB2株Tat罗白（长度101个氨基酸）的半胱氨酸富集区（22～37位氨基酸）以提高其在大肠杆菌中的表达量因子稳定性，并分析缺失半胱氨酸富集区后的Tat蛋白[Tat（ΔC）蛋白]免疫原性的改变。方法应用PCR方法对Tat基因的半胱氨酸富集区（64—111位核苷酸）进行缺失突变，获得其突变体序列[Tat（ΔC）DNA]，并构建其重组表达质粒pET-32a-Tat（ΔC）。相同的条件下将pET-32a-Tat（Δc）和pET-32a．Tat质粒转人大肠杆菌B121（DE3）中进行诱导表达及纯化。用pET-32a-Tat（ΔC）融合蛋白免疫家兔制备抗血清，ELISA和Western blot方法对抗血清进行免疫原性分析。结果pET-32a-Tat（ΔC）蛋白在大肠杆菌中的表达水平（7．12mg／m1）明显高于pET-32a-Tat蛋白（1．50mg／m1）；pET-32a-Tat蛋白在表达纯化后及25℃和4℃放置7d后均有明显二聚体的产生，而pET-32a-Tat（ΔC）蛋白则未形成二聚体；pET-32a-Tat（Δc）蛋白免疫家兔可诱导产生高滴度的抗体（1：320000），该抗体与Tat（Δc）蛋白、Tat蛋白（1—101AA）及化学合成Tat（1～86AA）蛋白均呈特异性反应。结论缺失HIV-1 Tat蛋白的半胱氨酸富集区可明显提高其原核表达水平和蛋白的稳定性并较好地保留其免疫原性，为HIV-1 Tat疫苗研究提供了一种新型免疫原。