水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因转化桑树获得转基因植株的初报

利用基因枪法将水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因 (OC)导入桑树组织 ,经抗性筛选和组织培养获得再生植株 ,通过对转基因植株的PCR Southern杂交及RNA点杂交等检测 ,证实OC基因转化桑树成功 ,为选育抗虫性桑树品种奠定了基础。

表达马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的Hela细胞的无血清培养

目的:使用无血清培养基培养可稳定表达马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(Brugia malayi cystatin,Bm-CPI)的人宫颈癌细胞(Hela)。方法:将已获得的Bm-CPI稳定转染的Hela细胞株,进行无血清培养并观察Hela细胞的维持时间和培养过程中Hela细胞的形态变化。结果:无血清培养基培养Hela细胞可维持细胞的正常生长。结论:无血清培养基可以逐步代替含血清的培养基,为后续Hela细胞扩大培养和Bm-CPI基因重组蛋白纯化提供依据。

广州管圆线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆表达及免疫保护作用研究

目的对广州管圆线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)基因进行克隆、原核表达,并对表达产物的免疫保护作用作出初步鉴定。方法将广州管圆线虫cystatin基因克隆入载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达。用纯化融合蛋白隔周免疫小鼠1次,共3次,设GST免疫及未免疫对照组,末次免疫后1w用广州管圆线虫Ⅲ期幼虫攻击感染,3w后剖杀小鼠,计算减虫率及保护率,并测定小鼠特异性IgG抗体水平变化。结果成功构建了pGEX-4T-1/cystatin重组表达质粒,并在大肠杆菌中得以高效可溶性表达,融合蛋白免疫小鼠后诱导产生了58.1%的减虫率及20%的保护率,与对照组相比减虫效果显著(P<0.01)。结论广州管圆线虫cystatin基因能在大肠杆菌中高效表达并可诱导小鼠产生一定水平的保护性免疫力。

蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因转染对小鼠黑色素瘤B16F1细胞基因表达谱的影响

背景与目的:本实验室已证明蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(snake venom cystatin,sv-cystatin)具有抗肿瘤侵袭转移作用,为了进一步阐明其分子机制,本研究利用高通量的基因芯片技术探讨sv-cystatin基因转染对小鼠黑色素瘤细胞(B16F1)基因表达谱的影响。方法:分别将pcDNA3.1/sv-cystatin及空载体pcDNA3.1转染B16F1细胞,建立稳定转染的B16F1/sv-cystatin及B16F1/pcDNA3.1细胞株,提取总mRNA,应用高通量的基因芯片技术检测差异表达基因,半定量RT-PCR法分别验证5个上调和5个下调的差异表达基因。结果:B16F1细胞经转染sv-cystatin后,共检测了1218个基因,其中有45个差异表达基因,21个基因表达上调(Ratio>3),24个基因表达下调(Ratio<0.5),这些基因的功能涉及细胞粘附迁移、细胞免疫调节、增殖分化与凋亡、基因转录和细胞内信号转导等方面。10个差异表达基因的RT-PCR验证结果与基因芯片分析结果相符。结论:Sv-cystatin不仅具有抑制细胞外基质的作用,而且还具有细胞免疫调节、增殖分化与凋亡、基因转录和细胞内信号转导等多种生物学功能。

蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因转染对小鼠黑色素瘤B16细胞蛋白质表达谱的影响

目的研究蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-cystatin)基因转染对小鼠黑素瘤细胞B16F1的蛋白表达谱的影响,探讨其抗肿瘤机制。方法采用双向电泳-质谱的蛋白质组学研究策略,分析稳定表达sv-cystatin的B16F1细胞系B16F1/cystatin与转染空载体的对照细胞B16F1/pcDNA3.1的蛋白表达谱的差别,筛选鉴定差异表达蛋白;用实时定量PCR和Western blot进一步确定实验结果;对蛋白组数据和前期基因组数据进行比较分析。结果 B16F1/cystatin和B16F1/pcDNA3.1细胞总蛋白的双向电泳图谱上共有匹配蛋白点(412±20)个,其中有11个蛋白的表达差异在2倍以上,5个上调,6个下调。这11个蛋白和1个仅在B16F1/cystatin中表达的蛋白经MALDI-TOF-MS分析,其中10个蛋白得到了鉴定,它们分属于代谢酶系、小G蛋白Ran调控分子、真核翻译因子、核苷酸激酶等。Western blot显示NM23和RhoGDI-beta的蛋白表达分别上调了(2.23±0.34)倍和(1.57±0.11)倍;实时定量PCR结果显示NM23、RhoGDI-beta、RANBP1的mRNA表达上调,eIF5A、eEF1-beta2、MDH1表达下调;与蛋白质组学研究结果一致。基于Gene Ontology的分析提示sv-cystatin作用的靶分子主要定位于细胞外周、质膜和细胞核,与转录、半胱氨酸蛋白酶活性、细胞凋亡等过程有关。结论 sv-cystatin可能通过调控抑癌基因NM23、RhoGDI等蛋白质发挥其抗肿瘤作用。sv-cystatin的主要靶分子可能是转录因子、分泌蛋白和质膜受体。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因及其在桑树害虫防治上的应用前景

综述了在烟草、水稻、马铃薯以及毛白杨等植物获得转水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因植株的研究成果。

豆梨半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆及胁迫表达

采用RT-PCR结合RACE技术,从中国梨砧木——豆梨成熟种子中克隆获得豆梨半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因（PcCPI）的cDNA全长序列,并通过半定量RT-PCR分析不同胁迫处理对该基因表达水平的影响.结果表明：（1）PcCPIcDNA序列长度为980 bp,开放阅读框78~812 bp,编码的多肽由信号肽（29个氨基酸）和成熟肽（216个氨基酸）组成,具有3个植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因家族的高保守特征序列模式——LARFAVQEHN、QX-VXG和YQAKVWVKPW.（2）该蛋白与蔷薇科植物的CPI蛋白处于系统发育树的同一分支,且与苹果CPI蛋白的一致性最高（95.9%）.（3）半定量RT-PCR结果显示：PcCPI基因在豆梨叶片中为诱导型表达,在人工模拟逆境条件下（包括喷施50μmol/L MeJA或100μmol/L ABA、刀片2次机械损伤2、00 mmol/L NaCl胁迫、4℃低温或30℃高温胁迫）处理4 h后,豆梨叶片中PcCPI基因表达量明显上升,表明该基因参与了豆梨对生物或非生物胁迫的防御机制.

无核荔枝半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因克隆及序列分析

[目的]对无核荔枝的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因进行克隆,并对其序列下进行分析。[方法]根据构建的无核荔枝胚败育SSH消减文库的半胱氨酸蛋白酶抑制剂EST序列,通过RACE技术获得半胱氨酸蛋白酶抑制基因的核苷酸序列并应用生物信息学软件进行分析。[结果]获得一个635 bp的半胱氨酸蛋白酶抑制基因序列,预测该序列含有321 bp的开放阅读框,推导其编码的蛋白质含106个氨基酸,具有半胱氨酸蛋白酶抑制剂保守区,与多个物种的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因具有较高的同源性。[结论]为进一步研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂在植物中的生理功能奠定了基础。

马铃薯半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(PCPI)在马铃薯晚疫病抗性中的功能表征研究

由于马铃薯半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(PCPI)构造载体双链RNA在疫霉抗性马铃薯品种中薯5号中瞬时表达,PCPI转录减少了93.94%。PCPI的沉默导致了病变尺寸和水浸的显著增长,表明半胱氨酸蛋白酶抑制剂能在限制病变扩张中发挥作用。本研究通过农杆菌渗入法生产了针对PCPI用于测试在马铃薯中获得瞬态基因沉默可能性的dsRNA构造,结果显示:在马铃薯植株叶片上的构造导致PCPI的下调和相应转录积累的降低;沉默的马铃薯基因编码了马铃薯晚疫病的半胱氨酸蛋白酶抑制剂,用以抵抗中薯5号品种破裂的阻力。该研究可用于生产稳定的敏感基因型的抗性转基因植物。

家蝇半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因MdCPI的克隆、表达及活性检测

半胱氨酸蛋白酶抑制剂是具有抑制半胱氨酸蛋白酶活性的一类蛋白超家族。本研究根据EST序列信息,通过RACE技术克隆得到1条家蝇Musca domestica半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因MdCPI,该基因含有1个357bp开放阅读框,编码118个氨基酸残基,推导的多肽N端17个氨基酸残基为信号肽序列。同源分析表明,MdCPI氨基酸序列与红尾肉蝇Sarcophaga crassipalpis的CPI相似性最高(identity=51%)。以邻接法(NJ)构建的系统树表明,家蝇与其他双翅目昆虫CPI起源于共同的祖先,属于I25A型蛋白家族。为了解家蝇CPI对半胱氨酸蛋白酶的抑制活性,构建pET-17b-MdCPI表达载体,并转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)进行重组表达。研究发现1μg重组家蝇CPI能够抑制约14μg木瓜蛋白酶的水解活性。结果表明MdCPI确属CPI家族,可能同其他家族成员具有相似的功能,参与免疫及生理调控。这些结果为研究MdCPI在家蝇体内作用机制奠定了基础。

小麦半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因家族的鉴定与表达分析

以小麦品种中国春的基因组为参考序列,利用Hummer search技术在小麦全基因组水平上对小麦TaCYS家族基因进行了鉴定。对TaCYS家族基因的进化关系、基因结构、保守基序列、顺式作用元件等进行了分析。结果表明,系统进化树分析将TaCYS分为A、B、C三类且同组的TaCYS的基因结构与motif分布相对保守。染色体定位显示,TaCYS位于除chr 6 A、chr 5 B外的19条染色体上。通过分析启动子区域的顺式作用元件,推测TaCYS基因的表达可能受到光照、温度、激素等因素的调控。对小麦转录组数据分析显示,大部分A类的TaCYS基因在小麦不同时期的根、叶、穗、粒中均表达,大部分B类与C类的TaCYS基因只在生殖发育时期的籽粒中表达。TaCYS基因在抵抗不同营养型真菌入侵时可能具有专一性,TaCYS35-D、TaCYS37-D能激活PTI反应,对生物胁迫的反应更为强烈。

细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆、表达及诊断价值的初步评价

探究细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基本特性并初步评价其诊断价值,旨在为细粒棘球绦虫的防控提供依据。本研究原核表达出Eg-cystatin重组蛋白并对其进行生物信息学、免疫印迹分析,用荧光免疫定位的方法检测该蛋白质的分布情况,并以绵羊细粒棘球蚴阳性血清评价Eg-cystatin重组蛋白的诊断价值。结果如下:Eg-cystatin生物信息学分析结果显示,该蛋白质含有一个N端信号肽以及cystatin结构域,是典型的2型半胱氨酸蛋白酶抑制剂,进化树分析显示Eg-cystatin属于绦虫cystatinⅡ型,并且与其他绦虫的cystatin相似性为72.20%~80.66%,免疫荧光定位发现该蛋白质主要分布在原头蚴的表皮和顶突钩,生发层,成虫虫体内部和虫卵。基于Eg-cystatin建立的间接ELISA方法的特异性为79.1%,敏感性为83.3%,与剖检符合率为81.25%。Eg-cystatin在成虫和幼虫时期均有表达,提示该基因与虫体生命活动息息相关,但Eg-cystatin蛋白不适合作为绵羊细粒棘球蚴病的诊断抗原候选。

水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆及其mRNA在水稻中的组成型表达

从40年代发现豆科植物中存在蛋白酶蛋白抑制剂以来,在动物、植物和微生物体内已发现普遍存在着多种类型的蛋白酶抑制剂(PI)。人们往往是为了研究某种蛋白酶的作用机制或出于某种应用目的去分离和研究PI的,对PI的真正生理功能尚不十分清楚。一般认为除防止体内不必要的蛋白降解作用、调节蛋白代谢及调节各种蛋白酶的生理活性外,很多植物的PI还具有抑制某些病源微生物及某些昆虫体内蛋白酶的作用,从而对植物有防卫功能。Hilder等和Johnson等已分别将属于丝氨酸蛋白酶抑制剂的豇豆蛋白酶抑制剂及马铃薯PⅠⅠ和PⅠⅡ基因转入烟草,结果转基因烟草对烟芽夜蛾(He-

大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因GmCYS2的功能鉴定

半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin,CYS)在结瘤,根瘤发育和衰老过程中起重要作用。本研究克隆了1个大豆CYS家族基因GmCYS2,氨基酸序列比对及进化树分析表明,GmCYS2与木豆(Cajanus cajan)CYS相似性最高。在体外对该基因编码蛋白进行了表达和纯化,重组蛋白GmCYS2的酶活性抑制实验显示,该蛋白对L类和B类组织蛋白酶的抑制活性明显高于对H类组织蛋白酶,并且在30 d根瘤提取物中的抑制活性高于在60 d根瘤提取物中。此外,构建GmCYS2的植物表达载体,通过百脉根毛根转化法获得转GmCYS2基因的超表达复合体植株。GmCYS2的超量表达增加了百脉根的结瘤数目,并且上调共生标记基因的表达。结果说明GmCYS2蛋白具有一定的酶活性抑制作用,并且正调控百脉根共生结瘤过程。

拟南芥半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因AtCYS6克隆及功能分析

为了研究拟南芥半胱氨酸蛋白酶抑制剂AtCYS6基因在植物生长发育过程中的作用与功能,从拟南芥中克隆了半胱氨酸蛋白酶抑制剂AtCYS6基因,并对该基因进行生物信息学分析,亚细胞定位分析,蛋白质诱导、表达、纯化及功能研究。结果表明,AtCYS6蛋白等电点为5.85,化学式为C1179H1848N322O348S6,共含有3703个原子数,为亲水性蛋白;AtCYS6与十字花科的荠菜、荠蓝的同源性较高,同源性分别为81.1%,80.3%,同水稻、玉米和大豆的同源性较低,同源性分别为55.5%,54.3%,56.6%,且在氨基酸序列中间具有高度保守的Q-V-G(Gln-Val-Gly)序列;同时进化树分析显示AtCYS6与同属于十字花科的荠菜、荠蓝的亲缘性较近,同水稻、玉米、高粱、谷子等禾本科植物的亲缘性较远;亚细胞定位结果显示其定位于细胞质,与预测结果相符合;蛋白质诱导、表达和纯化得到大小约为52 ku的融合蛋白,其中AtCYS6蛋白质的分子量约为26 ku,与预测值相符合;Western Blot分析显示,诱导表达的融合蛋白正确翻译表达,且没有出现结构上的断裂或者降解的情况;蛋白酶活性分析表明,AtCYS6对木瓜蛋白酶具有抑制作用。研究结果可以为下一步在植物体内研究该基因的相关机理作用提供基础。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂4在胰腺癌临床诊断及预后评估中的价值

目的:分析血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂4(CST4)表达水平在胰腺癌临床诊断及预后评估中的价值。方法:收集2020年10月—2023年1月就诊于河北医科大学第四医院的71例胰腺癌初诊患者,分别收集患者血常规、凝血功能、血生化及血清肿瘤标记物等指标检测结果及病例信息。分析胰腺癌患者与胰腺良性肿瘤患者血清CST4表达水平及其他临床实验室检测结果的差异,并制作受试者工作特征(ROC)曲线评价CST4在胰腺癌诊断及临床进展评估中的意义。绘制Kaplan-Meier生存曲线并采用多因素Cox回归分析比较CST4与传统肿瘤标记物癌胚抗原(CEA)和糖类抗原199(CA19-9)在胰腺癌临床预后评估中的价值。结果:与胰腺良性肿瘤对照相比,胰腺癌患者血清CST4、CEA及CA19-9含量异常的比例及中位值均明显升高(P<0.01)。ROC分析显示,CST4在胰腺癌诊断中的曲线下面积(AUC)为0.782,其与CEA和CA19-9联合检测AUC(AUC=0.930)较单项检测明显升高(P<0.05);而CST4在预测胰腺癌临床进展中显示出更高的价值(AUC=0.794),敏感度为80.90%,特异性为70.80%,阳性似然比为2.77,最佳截断值为84.41 U/mL;预后分析显示,CST4高表达组和CST4低表达组患者中位生存时间分别为6.2月和25.6月,差异有统计学意义(P<0.01);血清CST4表达水平升高是胰腺癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。结论:血清CST4表达水平可作为胰腺癌患者临床辅助诊断指标,是胰腺癌患者预后的独立危险因素。

血清肌酐/半胱氨酸蛋白酶抑制剂C比值对胰腺癌患者的早期诊断与预后价值

目的探讨血清肌酐/半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(sCr/CysC)比值对胰腺癌早期诊断和预后评估的价值。方法回顾性分析苏州大学附属第一医院2020年1月至2021年12月收治的60例初诊胰腺癌患者、30例胰腺良性肿瘤患者和30例健康对照者的临床资料。比较三组间sCr/CysC比值、C反应蛋白(CRP)、L3骨骼肌指数(L3-SMI)、Alb和CA199水平的差异。采用ROC曲线分析sCr/CysC比值对胰腺癌的诊断效能。根据sCr/CysC比值中位数将胰腺癌患者分为高比值组和低比值组,应用Kaplan-Meier生存曲线和Cox回归模型分析sCr/CysC比值对胰腺癌预后的预测价值。结果与胰腺良性肿瘤组和健康对照组相比,胰腺癌组的sCr/CysC比值和Alb水平显著降低,而CRP水平明显升高(均P<0.05)。与低sCr/CysC比值组相比,高比值组患者的性别构成、年龄和L3 SMI水平差异有统计学意义(均P<0.05)。sCr/CysC比值对胰腺癌的诊断ROC曲线下面积为0.640(95%CI:0.524~0.756,P<0.05),在cut-off值为0.69时敏感性为46.7%,特异性为83.3%。相关分析显示,sCr/CysC比值与L3-SMI呈正相关(r=0.425,P<0.01)。生存分析表明,高sCr/CysC比值组患者的中位生存期显著长于低比值组(379 d vs 210 d,P<0.01)。Cox回归分析确认sCr/CysC比值是胰腺癌预后的独立危险因素(HR=0.151,95%CI:0.028~0.826,P<0.05)。结论sCr/CysC比值可能是胰腺癌早期诊断和预后评估的有效指标,有望为胰腺癌的临床诊疗提供参考。

将水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin I)基因导入甘薯品种

本研究采用根癌农杆菌介导法以 12个甘薯品种作为受体材料 ,将OCI (OryzacystatinI)基因导入甘薯品种中 ,获取 7个品种的抗Kan再生植株 ,对获得的具有Kan抗性的再生植株进行PCR分子检测 ,初步结果证明已将外源OCI基因导入到 4个甘薯品种 (6个株系 )的基因组中。

血液可溶性生长刺激表达基因2蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、白介素6对A型主动脉夹层患者心脏手术相关急性肾损伤的预测价值

目的探讨血清可溶性生长刺激表达基因2蛋白(sST2)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CysC)和白介素6(IL-6)对A型主动脉夹层(ATAAD)患者术后心脏手术相关性急性肾损伤(CSA-AKI)的预测价值。方法纳入2022年4月至2024年3月在厦门大学附属心血管病医院确诊的112例ATAAD患者,根据术后是否发生CSA-AKI分为CSA-AKI组和非CSA-AKI组。另选取50例健康体检者作为对照组。分别检测各组术前及术后24h、72h血清sST2、CysC和IL-6水平,比较组间差异,并采用Lo-gistic回归和ROC曲线分析评估3种标志物对ATAAD术后CSA-AKI的预测效能。结果CSA-AKI组术前和术后sST2水平均显著高于非CSA-AKI组(P<0.05),非CSA-AKI组术前sST2水平高于健康对照组(P<0.05)。两组ATAAD患者术前IL-6水平均高于对照组(P<0.05)。CSA-AKI组术后24h、72hCysC水平明显高于非CSA-AKI组(P<0.05)。Logistic回归分析显示,术后24h、72hsST2和CysC水平与CSA-AKI发生风险显著相关(P<0.05)。ROC曲线证实,sST2和CysC对CSA-AKI有良好预测价值(P<0.05)。结论血清sST2和CysC是潜在的新型标志物,对ATAAD术后CSA-AKI具有早期预测和风险评估价值。

血清碱性磷酸酶、同型半胱氨酸及半胱氨酸蛋白酶抑制剂C与糖尿病足下肢动脉粥样硬化的关系

目的分析糖尿病足患者血清碱性磷酸酶(ALP)、同型半胱氨酸(Hcy)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys-C)水平与糖尿病足及下肢动脉粥样硬化(AS)的关系。方法收集2021年1月至2021年12月于山东中医药大学附属医院住院治疗的80例糖尿病足患者和36例同期健康体检者的临床资料,分别设为观察组和对照组。根据彩色多普勒超声测定的下肢股动脉内-中膜厚度(FAIMT)测定结果将观察组患者分为FAIMT增厚组(n=39)和斑块组(n=41)。比较各组患者的临床特征、血液指标[ALP、Hcy、Cys-C、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及空腹血糖(FBG)],采用多因素Logistic回归模型分析糖尿病足发生的危险因素,通过受试者操作特征(ROC)曲线确定ALP、Hcy、Cys-C对糖尿病足的诊断价值。结果观察组的年龄大于对照组,ALP、Hcy、Cys-C、FBG水平均高于对照组,TC、HDL-C水平均低于对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。斑块组患者的Hcy水平高于FAIMT增厚组患者,差异有统计学意义(P﹤0.05)。多因素分析结果显示,年龄、FBG、ALP、Hcy、Cys-C均是糖尿病足发生的独立危险因素(P﹤0.05)。ROC曲线分析结果显示,ALP、Hcy、Cys-C诊断糖尿病足的AUC分别为0.724、0.640、0.895,对糖尿病足均具有较好的诊断价值。结论ALP、Hcy、Cys-C与糖尿病足的发生密切相关,且与下肢AS程度有关,对糖尿病足患者病情的诊断具有重要临床意义。