华支睾吸虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子的分子生物学及免疫学定位研究(英文)

目的由华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选重要新基因并进行功能基因研究。方法生物信息学、基因克隆表达技术、免疫识别、S-P免疫组化等方法。结果由华支睾吸虫成虫cDNA文库成功分离到了CsRPEF(RNA聚合酶Ⅱ延长因子)基因。通过BLASTX程序同源性比对,显示CsRPEF基因与小鼠和人类的RPEF基因同源性为82%。成功构建了CsRPEF原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行了大规模诱导表达,所表达的GST融合蛋白经蛋白酶原切割后获得CsRPEF重组蛋白。凝胶扫描分析和Bradford法显示,CsRPEF重组蛋白的纯度和浓度分别为85%和(0.73±0.02)mg/ml。将CsRPEF重组蛋白接种至BALB/c小鼠进行免疫实验。间接ELISA法显示免疫小鼠抗体滴度达1∶150。免疫识别结果显示此抗体可识别20 ku CsRPEF重组蛋白和华支睾吸虫20 ku虫源性蛋白。S-P免疫组化方法显示CsRPEF主要定位于华支睾吸虫成虫的表皮、皮下组织和虫卵三部位。CsRPEF新基因序列GenBank的登录号为EU232119。结论CsRPEF基因是防治华支睾吸虫病生物药物研发的重要靶点。

华支睾吸虫成虫CsRPEF基因的生物信息学分析

目的筛选华支睾吸虫的功能基因并进行相应的生物信息学分析。方法使用PCGENE软件、Antheprot-5软件、ExPASy在线分析工具、NCBI上的Blastx程序进行华支睾吸虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(CsRPEF)基因的生物信息学分析。结果获得了CsRPEF基因的序列特征,推测到了CsRPEF的同源蛋白并预测出CsRPEF编码蛋白的分子量、等电点、柔曲性、疏水性、功能性位点等二级结构特征。结论华支睾吸虫成虫CsRPEF基因是一新筛选的功能基因,CsRPEF蛋白是可能参与华支睾吸虫基因转录途径的重要因子。CsRPEF基因的生物信息学分析可为其进一步进行生物学功能的实验研究奠定基础。

华支睾吸虫成虫RPEF基因产物及其抗RPEF多克隆抗体的制备

目的体外制备华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子（RPEF）基因产物及抗RPEF多克隆抗体。方法亲和纯化试剂盒纯化表达蛋白pGEx4T-1，RPEF，凝血酶酶切表达蛋白制备重组蛋白RPEF，将重组蛋白RPEF免疫小鼠，制备多克隆抗血清，检测抗体滴度和抗血清特异性。结果体外制备的RPEF蛋白经SDS电泳呈单一条带；酶联免疫吸附结果显示，免疫过程抗体滴度呈连续上升趋势；免疫印迹结果显示，小鼠抗血清具有抗RPEF特异性。结论获得较专一的华支睾吸虫RPEF蛋白和RPEF抗血清。