华蟾酥毒基通过调控circNFIX/miR-577通路抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭

目的:研究华蟾酥毒基(CnBu)对乳腺癌细胞MDA-MB-231恶性生物学行为的影响,并探讨其机制是否与调控环状RNA核因子IX(circNFIX)和miR-577表达相关。方法:将MDA-MB-231细胞分为对照(Con)组、CnBu-低剂量(L)组、CnBu-中剂量(M)组、CnBu-高剂量(H)组、si-NC组、si-circNFIX组、pcDNA组、pcDNA-circNFIX组、CnBu+pcDNA组、CnBu+pcDNAcircNFIX组。MTT、Transwell实验分析细胞增殖、迁移和侵袭能力,Westernblot分析Ki-67、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9蛋白表达。RT-qPCR分析circNFIX、miR-577表达量。双荧光素酶报告实验和RT-qPCR验证circNFIX和miR-577的靶向调控关系。结果:CnBu以剂量依赖方式下调Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白和circNFIX表达(P<0.05),上调miR-577表达(P<0.05),减弱MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.05)。miR-577与circNFIX序列直接结合,干扰或过表达circNFIX可显著提高或降低miR-577表达水平(P<0.05)。干扰circNFIX表达显著下调Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达(P<0.05),减弱MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.05)。过表达circNFIX显著减弱CnBu对MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭及相关蛋白表达的影响(P<0.05)。结论:CnBu可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭,可能通过下调circNFIX/miR-577通路实现。

基于转录组学探讨华蟾酥毒基抑制肝癌细胞增殖的作用机制

目的观察华蟾酥毒基(CBF)对肝癌细胞增殖的抑制作用,采用转录组学测序技术揭示相关基因及信号通路,探讨CBF抗肝细胞癌(HCC)的可能作用机制。方法用不同浓度的CBF(0、2、4、8、16和32μmol·L^(-1))处理人HCC细胞SMMC-7721和JHH7,时间梯度为24、48和72 h,WST-1试剂盒检测细胞增殖情况。根据WST-1试剂盒检测结果,用CBF 2μmol·L^(-1)干预SMMC-7721和JHH7细胞24 h,然后进行转录组学基因表达测序分析差异表达基因,并行生物信息学分析。基于文献报道及TCGA数据库观察部分差异表达基因在HCC组织中的表达情况,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)技术检测并验证CBF靶基因的表达情况。结果①CBF对SMMC-7721和JHH7细胞具有抑制增殖作用,且呈浓度-时间依赖性。②转录组学测序结果显示,经CBF干预后,SMMC-7721细胞获得差异表达基因共计578个(其中上调基因309个、下调基因269个),JHH7细胞获得差异表达基因共计611个(其中上调基因349个、下调基因262个),两组细胞获得的交集基因共有106个(差异倍数>2,P<0.05)。③生物信息学分析显示,激活转录因子3(ATF3)、羰基还原酶1(CBR1)、细胞骨架相关蛋白4(CKAP4)、生长停滞和DNA损伤可诱导蛋白β(GADD45B)、钾二孔域通道亚科K成员5(KCNK5)、起源识别复合亚基5(ORC5)基因的转录水平在HCC组织中呈异常表达并与患者预后相关。④RT-qPCR结果显示,CBF能促进ATF3、KCNK5和GADD45B基因的表达,抑制CBR1、CKAP4和ORC5基因的表达,与测序结果一致。结论CBF具有抑制HCC细胞增殖的作用,其机制可能与调控ATF3、KCNK5、GADD45B、CBR1、CKAP4和ORC5基因表达有关。

高效液相色谱-质谱联用法测定喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基

建立高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)测定喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量的方法。采用HPLC-MS正离子多反应监测模式进行测定,色谱柱为Thermo Hypersil BDS C18(250.0 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-1%乙酸溶液(38∶62),流速为0.5 mL/min,检测波长为296 nm,柱温为20℃。质谱条件:鞘气流速40 arb,辅气流速5 arb,喷雾电压4.5 kV,毛细管温度300℃。结果显示,华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的检测质量浓度线性范围均为50~300μg/mL(r=0.9992),重复性试验、精密度试验、稳定性(12 h)试验的RSD均小于1.00%(n=5或n=6),加样回收率分别为101.8%(RSD为2.61%,n=6)和100.9%(RSD为3.20%,n=6)。该方法灵敏度高、重复性好,能准确测定喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量,可用于喉症丸的质量控制。

氯通道在华蟾酥毒基诱导的鼻咽癌细胞凋亡中起重要作用

目的:研究氯离子通道在华蟾酥毒基(CBG)诱导低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞凋亡和凋亡性容积减小中的作用。方法:实验设立空白对照组、CBG高、中、低剂量组及CBG与氯通道阻断剂NPPB联合作用组。Hoechst 33342染色检测细胞的凋亡率,活细胞图像分析法检测细胞容积变化,全细胞膜片钳法记录氯电流。结果:(1)CBG浓度依赖性诱导鼻咽癌细胞凋亡,高剂量CBG(8μmol/L)诱导的细胞凋亡率为43.2%;(2)CBG可诱导细胞产生凋亡性容积减小,在CBG作用早期(50 min),细胞容积减小约9.9%。(3)CBG可激活氯通道,产生一个无明显外向优势的氯电流。(4)氯通道阻断剂NPPB可抑制CBG诱导的细胞凋亡、凋亡性细胞容积减小和氯电流。NPPB对CBG诱导的细胞凋亡和凋亡性容积减小的抑制率分别达80.1%和74.8%。结论:以上结果提示CBG可能通过激活氯通道而诱导细胞凋亡,氯通道的激活可能在CBG抗肿瘤机制中起重要作用。

液相色谱法测定强力救心滴丸中蟾酥的华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量

目的:测定强力救心滴丸中蟾酥的主要成分华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量。方法:样品经甲醇超声处理提取,采用高效液相色谱法测定,色谱柱为 Alltima C_(18)色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);柱温:40℃;流速:1mL·min^(-1);流动相:乙腈-0.5%磷酸二氢钾(pH=3.2)(50:50);检测波长:296nm。结果:华蟾酥毒基在0.25-1.51μg范围内、酯蟾毒配基在0.26-1.55μg范围内具有良好线性关系。华蟾酥毒基平均加样回收率为99.6%,RSD=2.1%(n=5);酯蟾毒配基平均加样回收率为98.2%,RSD=1.4%(n=5)。结论:该法准确、可靠,可用于强力救心滴丸中蟾酥的酯蟾毒配基和华蟾酥毒基含量测定。

高效液相色谱法测定蟾酥药材中脂蟾毒配基和华蟾酥毒基的含量

目的建立蟾酥药材中脂蟾毒配基和华蟾酥毒基的含量测定方法 ,并对不同品质的药材中2种成分进行含量测定。方法采用高效液相色谱法,色谱柱：Phenomenex C18柱（4.6 mm×250 mm,5μm）;流动相：乙腈-0.3%乙酸溶液,梯度洗脱,流速：0.7 mL.min-1;检测波长：296 nm;柱温：30℃。结果脂蟾毒配基在0.032 52.080μg与峰面积线性关系良好（r=0.999 7）,回收率为99.6%,RSD=2.0%;华蟾酥毒基在0.031 92.040μg与峰面积线性关系良好（r=0.999 6）,回收率为102.5%,RSD=2.0%。结论该法可靠、准确、简便,可作为蟾酥药材的质量控制方法 。

华蟾酥毒基抑制人骨肉瘤细胞迁移和侵袭的机制研究

目的观察华蟾酥毒基对人骨肉瘤(HOS)细胞迁移与侵袭的影响,并探讨其可能的作用机制。方法应用慢病毒载体LV-vector、LV-over/PLOD2转染HOS细胞并建立稳定转染株HOS/NC、HOS/PLOD2;划痕和细胞侵袭实验检测华蟾酥毒基对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响;实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测华蟾酥毒基对PLOD2 mRNA表达的影响;Western blot法检测华蟾酥毒基对PLOD2及FAK-JAK/STAT3信号通路相关蛋白(PLOD2、FAK、p-FAK、JAK、p-JAK、STAT3、p-STAT3)表达的影响。结果划痕和细胞侵袭实验结果显示,华蟾酥毒基可降低HOS细胞的迁移和侵袭能力,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01),但过表达PLOD2后,华蟾酥毒基抑制HOS/PLOD2细胞迁移和侵袭的能力减弱,与HOS/NC细胞相比,差异有统计学意义(P<0.01);qRT-PCR结果显示,不同浓度的华蟾酥毒基均可下调HOS细胞PLOD2 mRNA表达水平;Western blot结果显示,华蟾酥毒基可下调HOS/NC细胞中PLOD2及FAK-JAK/STAT3通路相关蛋白p-FAK、p-JAK、p-STAT3等的表达,但对HOS/PLOD2细胞中PLOD2及FAK-JAK/STAT3信号通路相关蛋白的作用明显减弱。结论华蟾酥毒基抑制骨肉瘤迁移与侵袭的机制可能与下调PLOD2,进而阻断FAK-JAK/STAT3信号通路有关。

HPLC法测定心宝丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量

目的:建立测定心宝丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量的方法。方法:采用反复高效液相色谱法,色谱柱Agilent HC-C18(5μm,4.6 mm×250 mm),流动相为0.5%磷酸二氢钾溶液-乙腈(62∶38,用磷酸调节pH值为3.2),流速1.0 ml/min,柱温35℃,检测波长296 nm。结果:华蟾酥毒基回收率102.9%,RSD=2.0%;脂蟾毒配基回收率100.0%,RSD=1.8%;结论:本法准确,可用于控制药品质量。

蟾饲五谷虫中华蟾酥毒基的含量测定

目的建立反相高效液相色谱法测定蟾饲五谷虫中华蟾酥毒基的含量。方法采用Ecosil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-5 g.L-1磷酸二氢钾溶液(体积比38∶62)(用磷酸调节pH值为3.2)为流动相,检测波长为296 nm,柱温为40℃,流速为1.0 mL.min-1。结果华蟾酥毒基的线性范围为6.0～30.0 mg.L-1(r=0.998 7,n=5),平均回收率为100.0%(RSD=1.54%,n=6)。结论该方法操作简便、结果准确,可用于蟾饲五谷虫的质量控制。

高效液相色谱法测定心可宁胶囊中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量

用HPLC法测定心可宁胶囊中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;0.5%磷酸二氢钾溶液-乙腈(50∶50)(用磷酸调pH值3.2)为流动相分离效果最佳。平均回收率华蟾酥毒基为99.29%,RSD为1.47%;脂蟾毒配基为99.13%,RSD为1.65%(n=5)。本法简单、灵敏、重复性好。

干蟾皮中酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的纯化及其体外抗结肠癌活性的研究

目的：探讨干蟾皮中酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的分离和纯化方法,并考察其体外抗结肠癌活性。方法：采用硅胶柱层析法纯化干蟾皮中的酯蟾毒配基和华蟾酥毒基,考察径高比、上样量及洗脱曲线对酯蟾毒配基和华蟾酥毒基纯化的影响;采用MTT法测定纯化产物对结肠癌细胞CT-26的生长抑制作用,考察其体外抗结肠癌活性。结果：纯化条件径高比为2∶14,上样量为10g（干蟾皮原生药材）,洗脱溶剂用量为160m L。在9.32~300μg/m L浓度范围内纯化产物对结肠癌细胞有较强的抑制作用,并且呈时间和剂量依赖关系。结论：硅胶柱层析法适合于干蟾皮中脂蟾毒配基和华蟾酥毒基的分离、纯化,且纯化产物体外抗结肠癌作用明显。

高效液相色谱-串联质谱法测定肝组织中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基

目的建立灵敏、准确的高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定肝组织中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量的方法。方法肝组织匀浆液中加入内标地塞米松,用二氯甲烷提取后挥干,残渣加入甲醇溶液溶解并上样到ProElut C18固相萃取柱上分离净化,应用HPLC-MS/MS正离子多反应监测模式测定。结果肝组织中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基分别在1~204 ng/g和1~206 ng/g范围内线性关系良好。检测限（S/N≥3）均为0.3 ng/g。基质效应为96.5%~126.7%。萃取回收率为70.0%~82.3%。日内及日间精密度均小于10%。结论所建方法灵敏、可靠,能满足法医毒物分析的鉴定需要。

HPLC法同时测定救心丸中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基含量

目的:建立救心丸中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量测定方法。方法:色谱柱:C18(250 mm×4.6 mm,5μm);柱温:40℃;流动相:乙腈-0.5%磷酸二氢钾(pH=3.2)(50∶50);流速:1.0 ml/min;检测波长:296 nm。结果:华蟾酥毒基在0.498～2.490μg范围内线性关系良好;脂蟾毒配基在0.570～2.850μg范围内线性关系良好。结论:本方法简便、准确,重复性好,可作为救心丸的质量控制方法。

华蟾酥毒基药理作用及剂型研究进展

华蟾酥毒基(Cinobufagin)是蟾酥中的一种单体,具有多种生物学效应,目前对其功效研究颇多,剂型研究也较多,现对华蟾酥毒基药理作用及制剂研究状况进行简要总结,为制备高效实用的临床药物提供有益线索。

HPLC法测定“心力丸”中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量

目的建立测定心力丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量的方法。方法采用反相高效液相色谱法,色谱柱Spherisorb C18(5μm,4.6mm×200 mm),流动相为0.5%(ω)磷酸二氢钾溶液-乙腈(体积比60∶40)(用磷酸调节pH值为3.2),流速1.0 mL/m in,柱温35℃,检测波长为296 nm。结果华蟾酥毒基回收率99.20%,RSD=1.27%;脂蟾毒配基回收率99.40%,RSD=0.86%。结论本法简便、准确,可用于控制该制剂质量。

RP-HPLC测定牛黄消炎片中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量

目的 :建立牛黄消炎片 (牛黄、大黄、珍珠母、蟾酥等 )中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的高效液相含量测定方法。方法 :WatersSymmetryShieldRP1 8(3.9mm× 2 5 0mm ,5 μm) ,流动相为乙腈 0 .5mol·L-1 磷酸二氢钾溶液 (pH用磷酸调节值至3.2 ) (42∶5 8) ;柱温 30℃ ;流速 1 .0mL·min-1 ,检测波长为 2 96nm。结果 :华蟾酥毒基线性范围为 0 .0 6 96～ 0 .835 2 μg ,精密度试验RSD为 0 .72 %,稳定性试验RSD为 0 .5 6 %,重现性试验RSD为 4 .2 8%,回收率为 1 0 0 .0 6 %,RSD为 1 .2 5 %;脂蟾毒配基线性范围为 0 .1 5 76～ 0 .94 5 6 μg ,精密度试验RSD为 0 .4 3%,稳定性试验RSD为 0 .84 %,重现性试验RSD为 4 .35 %,回收率为 1 0 0 .5 4 %,RSD为 1 .4 9%。结论 :本方法快速、准确、重现性较好 ,结果可靠 ,为牛黄消炎片提供有效的质量评价方法。

HPLC测定清金得生片华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量

目的:建立清金得生片中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量测定方法。方法:采用Hypersil ODS色谱柱(250mm×4mm,5μm);以乙腈-0.5%磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH至3.2)(45:55)为流动相;检测波长为296nm;柱温35℃。结果:华蟾酥毒基和酯蟾毒配基分别在0.04～1.25μg(r=0.999 9)、0.04～1.24μg(r=0.9998)范围内线性关系良好,加样回收率分别为99.37%(RSD=1.71%),100.20%(RSD=1.37%)。结论:方法简便、结果准确。

华蟾酥毒基对肝癌HepG2细胞c-Src基因表达的影响

目的观察华蟾酥毒基作用于HepG2细胞后,c-Src基因的表达改变。方法华蟾酥毒基作用于HepG2细胞6 h后,提取细胞RNA和蛋白,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测c-Src mRNA的表达变化,Western blot法检测c-Src蛋白的表达。结果华蟾酥毒基作用于HepG2细胞6 h后,c-Src mRNA和蛋白的表达均降低。结论华蟾酥毒基可在转录和翻译水平上抑制HepG2细胞c-Src的表达。

HPLC法测定腹痛水华蟾酥毒基的含量

建立了高效液相测定腹痛水中华蟾酥毒基含量的方法。色谱柱：SHIMADZU VP-ODS C18（4.6 mm×250mm）;以0.5%磷酸二氢钾溶液-乙腈（50∶50）（用磷酸调节pH值为3.2）为流动相;检测波长为296 nm;柱温35℃。华蟾酥毒基在1.27-508μg/ml浓度范围内与峰面积均呈良好的线性关系（r=1.0000）。华蟾酥毒基平均加样回收率为102.19%,RSD=1.47%（n=6）。该方法简便、重现性好、灵敏度高,可用于腹痛水的质量控制。