共刺激分子超家族成员sPD-1和OX40对关节炎小鼠的脾CD4+T细胞和血清细胞因子水平的影响

目的探讨共刺激分子超家族成员sPD-1和OX40对类风湿性关节炎(CIA)模型小鼠CD4+T细胞和血清细胞因子水平的影响,并探讨其机制。方法用DBA/1小鼠建立CIA模型,分别免疫诱导35 d和49 d。小鼠分为9组,每组10只,包括正常对照组(NC组)、急性CIA组(A-CIA组,免疫诱导35 d)、慢性CIA组(C-CIA组,免疫诱导49 d)、sPD-1组(0.1 mg/kg,i.p.)、OX40组(15 mg/kg,i.p.)、sPD-1+OX40组(0.1 mg/kg sPD-1联合15 mg/kg OX40蛋白,i.p.)、PD-1抑制剂AUNP-12组(0.2 mg/kg,i.p.)、siOX40组(60μg OX40的siRNA注射,i.v.)、阴性对照siOX40-Ctrl(60μg,i.v.)。对CIA模型小鼠的踝关节进行H&E染色并进行病理和关节肿胀评分,ELISA检测sPD-1、OX40、IL-2、IL-5、IL-4、IL-17、INF-γ水平;流式细胞术分析PD-1和OX40阳性CD4+T细胞的水平。蛋白免疫印迹分析NF-κB信号蛋白表达。结果sPD-1和OX40在CIA小鼠血清和CD4+T细胞上的表达均增加(均P<0.01);s PD-1联合OX40注射明显促进CIA模型小鼠的细胞因子IL-2、IL-5、IL-4、IL-17、INF-γ的分泌,并上调pP65的(P<0.05),抑制sPD-1和沉默OX40对CIA小鼠的细胞因子IL-2、IL-5、IL-4、IL-17、INF-γ的分泌有显著抑制作用,并抑制小鼠滑膜组织IKKβ、p-P65的表达,上调IκBα的表达(P<0.05)。结论sPD-1和OX40协同调控关节炎小鼠的炎症水平,sPD-1和OX40信号的失衡是关节炎动物机体免疫炎症的关键调节因素。

滋水清肝饮加减方对2型糖尿病患者正性共刺激分子ICOS/ICOSL、OX40/OX40L免疫调节作用的影响

目的:研究滋水清肝饮加减方对2型糖尿病患者正性共刺激分子ICOS/ICOSL、OX40/OX40L的免疫调节作用的影响。方法:随机抽取2016年1月—2017年3月本院收治的90例2型糖尿病患者,依据治疗措施差异分作两组,各45例,对照组施予甘精胰岛素治疗,于此基础,观察组施予滋水清肝饮加减方治疗,比较两组正性共刺激分子ICOS/ICOSL、OX40/OX40L。结果:治疗后,(1)在B细胞上,观察组ICOS/ICOSL表达(0.71±0.04)%,OX40/OX40L(6.05±0.83)%,分别比对照组的(2.11±0.37)%及(11.58±2.10)%低,差异有统计学意义(P<0.05);(2)在CD4+T细胞上,观察组ICOS/ICOSL表达(0.61±0.01)%,OX40/OX40L(0.30±0.03)%,分别比对照组的(1.60±0.17)%及(1.13±0.20)%低,差异有统计学意义(P<0.05);(3)对于合并大血管病变者,观察组B细胞、CD4+T细胞上的ICOS/ICOSL、OX40/OX40L表达均比对照组低,差异有统计学意义(P<0.05);(4)观察组血糖及总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、糖化血清蛋白(Glucosylated serum protein,GSP)水平均比对照组低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:于2型糖尿病患者中施予滋水清肝饮加减方治疗有助于改善正性共刺激分子ICOS/ICOSL、OX40/OX40L的免疫调节作用,促进合并大血管病变者转归,值得推广。

系统性红斑狼疮患者外周血共刺激分子OX40/OX40L表达及其意义

目的:探讨外周血共刺激分子OX40和OX40L在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血T、B细胞上的表达及其意义。方法:采用流式细胞仪检测技术对62例SLE患者和40例健康志愿者外周血T细胞上OX40和B细胞上OX40L的表达水平进行分析。结果:与健康对照组比,SLE患者组外周血CD4^+T细胞OX40表达水平显著高于健康对照组,而CD8^+T细胞OX40表达水平较对照组无明显变化;SL正患者组外周血B细胞上OX40L表达率较健康对照组显著升高(P<0.05);SLE活动期患者组外周血CD4^+T细胞上OX40及B细胞上OX40L的表达率明显高于非活动组;SLE患者组治疗后OX40和OX40L表达率随病情好转而下降。结论:SLE患者外周血CD4^+T细胞上OX40及B细胞OX40L表达水平明显上调,随着病情的好转,CD4^+T细胞上OX40及B细胞OX40L表达水平明显下调,提示OX40/OX40L信号在T细胞与B细胞相互作用过程中可能有助于T细胞的持续活化,从而参与SLE的发生发展。

协同刺激分子CD28/B7及CD40/CD40L在哮喘特异性免疫治疗中的作用

目的探讨协同刺激分子CD28/B7-1、CD28/B7-2及CD40/CD40L在哮喘发病中的作用及在特异性免疫治疗前后表达水平的变化。方法选择30例哮喘患者为实验组,30例健康人群为对照组。采用流式细胞仪方法比较两组间T、B淋巴细胞表面CD28/B7-1、B7-2及CD40/CD40L的表达及与血清总IgE水平的相关性,以及哮喘患者特异性免疫治疗前后T、B淋巴细胞表面CD28/B7-1、B7-2及CD40/CD40L的表达水平。结果与健康人群相比,哮喘患者CD28、CD40L、B7-2及CD40表达水平均增高。血清总IgE水平与T淋巴细胞表达CD40L水平呈正相关。特异性免疫治疗6个月后,哮喘患者T、B淋巴细胞表达的CD28/B7-2及CD40/CD40L水平均有所下调,但均未达正常水平。结论协同刺激分子CD28/B7-2及CD40/CD40L表达水平的上调在哮喘发病中可能起重要作用,特异性免疫治疗能下调哮喘患者CD28/B7-2及CD40/CD40L的表达水平,并可能由此间接下调血清总IgE水平,起到相应的治疗作用。

OX40/OX40L共刺激信号分子在慢性乙肝病毒感染者外周血中的表达研究

目的:探讨OX40/OX40L共刺激信号分子在慢性乙肝病毒(HBV)感染者外周血中的表达情况。方法:选取2019年6月—2020年6月本院收治的慢性HBV感染患者82例为观察组,同期选取健康体检者80例为对照组。观察组分为免疫耐受组、免疫清除组、低复制组、再活动组4个亚组,比较各亚组白蛋白/球蛋白(A/G)、总胆红素(TBIL)、谷丙转氨酶(ALT)等肝功能指标,以及肝功能与OX40/OX40L表达水平的相关性。结果:观察组外周血T细胞亚群CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)、CD_(4)^(+)、CD_(3)^(+)较对照组低,CD_(8)^(+)较对照组高(P<0.05)。观察组外周血CD_(4)^(+)、CD_(14)^(+)、CD_(19)^(+)T细胞表面的OX40/OX40L较对照组表达水平高(P<0.05)。4个亚组外周血CD_(4)^(+)T细胞表面的OX40表达水平比较,再活动组最高,其次是免疫清除组、低复制组,免疫耐受组最低(P<0.05);4个亚组CD _(14)^(+)、CD_(19)^(+)T细胞表面的OX40L表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。4个亚组肝功能指标A/G水平依次降低,ALT、TBIL水平依次升高,差异有统计学意义(P<0.05)。OX40/OX40L表达水平与肝功能指标ALT、A/G呈正相关(P<0.05),与TBIL不具相关性(P>0.05)。结论:慢性乙肝患者外周血OX40/OX40L分子表达水平与病例发展阶段、肝功能指标具有相关性,活动性越高,表达水平越高,肝功能受损越严重,借助于检测OX40/OX40L表达,可反映患者免疫功能。

人OX40-Fc分子的构建、真核表达及活性研究

目的 构建人OX4 0 Fc基因的真核表达质粒 ,并表达有生物学活性的纯化人OX4 0 Fc融合蛋白。方法 从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法扩增OX4 0膜外区cDNA编码基因 ,并导入真核表达载体pcDNA3中。测序证实后 ,进行酶切并与人IgG1Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中 ,采用脂质体法稳定转染COS 7细胞 ,用夹心ELISA检测其表达情况 ,经蛋白A亲和纯化 ,用SDS PAGE与Westernblotting进行鉴定。检测其对活化后Jurkat细胞增殖的抑制活性。结果 测序证实构建的OX4 0膜外区与OX4 0 FccDNA阅读框完整 ,连接部位序列正确 ;ELISA证实OX4 0 Fc蛋白的表达 ;SDS PAGE与Westernblotting证实其为OX4 0 Fc蛋白。增殖实验证明其对活化后的Jurkat细胞有抑制增殖作用。结论 成功构建了人OX4 0 Fc真核表达载体 ,并使有生物学活性的OX4 0 Fc融合蛋白在COS 7细胞上获得了稳定表达。

协同刺激分子与自身免疫性甲状腺病

自身免疫性甲状腺病(AITD)是T淋巴细胞介导的器官特异性自身免疫病,协同刺激分子在AITD异常免疫反应的启动、维持和效应阶段均发挥重要作用。除了CD28/细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)-4-B7分子之外,CD40CD40配体、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)-CD54、可诱导协同刺激分子(ICOS)-ICOS配体以及凋亡分子也参与了介导AITD的免疫功能紊乱。对协同刺激分子的深入研究,可以加深对AITD发生机制的认识,从而为临床提供新的免疫治疗途径。

重症肌无力患者外周血CD4^+T细胞OX40的表达及作用机制研究

目的分析重症肌无力(MG)患者外周血CD4+T细胞协同刺激分子OX40表达及其对FoxP3+CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)的调控作用,初步探讨OX40在MG免疫学发病中的作用机制。方法以流式细胞技术检测42例MG患者及38名健康对照的外周血OX40+CD4+T细胞、FoxP3+CD4+CD25+Treg表达水平,比较OX40表达在MG患者不同临床疾病状态、Osserman分型、临床绝对评分、胸腺病理类型等情况下的差异,并分析OX40对FoxP3+CD4+CD25+Treg细胞的影响。结果 (1)MG患者外周血OX40+CD4+T细胞占淋巴细胞百分比高于健康对照组(P<0.01)。(2)MG患者OX40+CD4+T细胞百分比在发作或加重期高于缓解期(P<0.05);在临床绝对评分呈中、重度患者OX40+CD4+T细胞百分比高于轻度患者(均P<0.05);OssermanⅡ、Ⅳ型患者OX40+CD4+T细胞百分比高于Ⅰ型患者(均P<0.05);胸腺增生及胸腺瘤患者OX40+CD4+T细胞百分比高于胸腺正常患者(P<0.05,P<0.01)。(3)MG患者外周血OX40+CD4+T细胞百分比与FoxP3+CD4+CD25+Treg细胞百分比呈负相关(r=-0.843,P=0.01)。结论协同刺激分子OX40参与MG发病,可能通过抑制FoxP3+CD4+CD25+Treg细胞生成发挥作用。

OX40分子与肿瘤免疫

T细胞的活化过程除需要TCR识别MHC-肽复合物作为第一信号外，还必需协同刺激信号（costimulatory signals）对其进一步充分活化。OX40作为肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员，为Ⅰ型跨膜蛋白，与CD28、CD40L等共同作为T细胞-抗原提呈细胞相互作用的主要参与者。本文拟就OX40的结构、生物学功能及其目前在肿瘤免疫中应用的研究进展作一综述。

协同刺激分子与自身免疫性甲状腺病

协同刺激分子是免疫系统B细胞和T细胞活化以及T、B细胞间相互作用的重要调节因子。协同刺激分子特别是CD40 /CD40L间的反应过度是导致自身免疫性甲状腺病 (AITD)发生的一个重要因素。抗CD40L治疗有望成为治疗该病的有效新途径。

带状疱疹皮损组织中CD8,FoxP3和OX40的表达研究

目的探讨带状疱疹(HZ)皮损组织中CD8、FoxP3和OX40的表达情况和意义,初步探讨OX40和CD8+Tregs细胞在HZ疾病过程中的作用机制。方法应用免疫组化法检测9例HZ患者皮损组织中CD8、FoxP3和OX40的表达情况,并分析其在不同临床病情HZ患者皮损组织中的表达差异。结果带状疱疹皮损组织中CD8、FoxP3和OX40的阳性表达率与病情有统计学意义(P<0.05),但与年龄无关(P>0.05)。HZ皮损组织中CD8、FoxP3和OX40间呈正相关(P<0.05)。结论 CD8、FoxP3和OX40可能在HZ的发生发展中起重要作用,共刺激分子OX40可能促进了CD8+Tregs细胞生成发挥作用。

OX40和OX40L在原发性干燥综合征患者外周血中的表达及临床意义

目的检测原发性干燥综合征(pSS)患者外周血单个核细胞表面共刺激分子OX40和OX40L的表达,并探讨其临床意义。方法采用免疫荧光标记流式细胞技术检测51例pSS患者及36例健康志愿者外周血T细胞表面OX40的表达及CD14+单核细胞和CD19+B细胞表面OX40L分子表达,比较11例初诊pSS患者治疗前后OX40和OX40L表达水平变化,分析其临床意义。结果与健康志愿者相比,pSS患者外周血CD4+T细胞表面OX40表达显著增高(8.65%±3.51%vs 5.68%±1.68%,P<0.01),而CD8+T细胞表面OX40的表达无统计学差异。pSS患者表面OX40L的表达,在外周血中CD14+单核细胞(6.76%±3.60%vs 3.15%±1.89%,P<0.01)和CD19+B细胞(4.69%±2.40%vs 2.76%±1.33%,P<0.01)中均高于健康志愿者。活动期的pSS患者外周血OX40和OX40L的表达高于非活动期患者,伴发多系统损伤pSS患者外周血OX40和OX40L分子的表达显著高于单纯外分泌腺损伤患者。治疗后CD4+T细胞表面OX40的表达及CD14+单核细胞和CD19+B细胞表面OX40L的表达显著下降。结论 pSS患者外周血单个核细胞表面OX40和OX40L异常高表达,且与疾病活动度、组织损伤及治疗密切相关。

人可溶性OX40L蛋白ELISA检测试剂盒的研制及其在自身免疫性疾病诊断中的应用

目的研制特异性检测人可溶性OX40L蛋白(sOX40L)的ELISA试剂盒,探讨其在自身免疫性疾病临床诊断中的应用。方法利用两株识别不同抗原表位的鼠抗人OX40L单克隆抗体1G1和4C12分别作为包被抗体和检测抗体,采用双抗体酶联免疫夹心法研制特异性检测人sOX40L的ELISA方法,并对其稳定性、精确性和特异性进行分析。结果①建立的检测人sOX40L酶联免疫试剂盒在抗原浓度为3.91～250ng/ml范围内有良好的线性关系,并具有良好的稳定性、较高的准确性和特异性。②利用该ELISA方法检测到sOX40L蛋白在肾病综合征和Graves’病患者血清中表达水平均显著高于健康对照组。结论成功建立了检测人sOX40L蛋白的ELISA试剂盒,应用该方法检测到sOX40L在多种自身免疫病患者血清中异常高表达。该试剂盒在OX40L分子基础研究以及自身免疫病的临床诊断方面具有潜在的应用价值。

OX40信号及其在神经系统自身免疫性疾病的研究

OX40信号是T细胞活化的协同刺激信号之一,参与T细胞增殖、存活、效应T细胞的分化、记忆性T细胞的扩增等,其在重症肌无力、多发性硬化、实验性自身免疫性脑脊髓炎等神经系统自身免疫性疾病病灶中有异常表达,可能会成为免疫干预疾病的靶向。

布地奈德抑制哮喘小鼠肺组织OX40、气道炎症和气道高反应性的研究

目的:研究布地奈德对哮喘模型小鼠肺组织OX40(CD134)表达、气道炎症和气道高反应性的干预作用。方法:18只SPF级BALB/c小鼠随机分为正常组、哮喘组、布地奈德组。卵蛋白(ovalbumin,OVA)致敏和激发建立哮喘模型。末次激发24 h后,测定气道反应性,HE染色观察炎症细胞浸润,ELISA法分别检测血清总IgE、OVA特异性IgE(OVA-sIgE)以及支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的IL-4和IL-13。Western blot检测肺组织OX40蛋白表达。结果:随着氯化乙酰胆碱(Ach)浓度的增加,哮喘组小鼠气道阻力明显增加,正常组仅轻度增加,布地奈德组小鼠气道阻力的增加程度低于哮喘组小鼠(P<0.05);在BALF中炎症细胞总数和嗜酸性粒细胞分类计数方面,哮喘组小鼠高于正常组小鼠(P<0.05),布地奈德组小鼠与哮喘组小鼠相比明显降低(P<0.05);在BALF中IL-4、IL-13和血清总IgE、OVA-sIgE方面,哮喘组高于正常组(P<0.05),布地奈德组低于哮喘组小鼠(P<0.05);哮喘组小鼠肺组织OX40高于正常组(P<0.05),布地奈德组与哮喘组相比小鼠肺组织OX40降低(P<0.05)。结论:布地奈德可抑制哮喘模型小鼠气道炎症和气道高反应性,可能与抑制OX40/OX40L协同刺激通路有关。

OX40在免疫治疗中的应用

OX4 0及OX4 0配体 (OX4 0L)是一对在T细胞初次和再次应答中都发挥重要作用的共刺激分子[1] ,它们对于维持CD4 + T细胞的增殖、存活 ,记忆性T细胞的形成起到关键作用 ,从而影响细胞免疫、体液免疫应答以及免疫耐受。越来越多的研究显示 ,OX4 0在调节自身免疫性疾病 ,治疗移植物抗宿主病 (GVHD)中有明显疗效 ,尤其在抗肿瘤、抗感染疫苗设计中有很好的应用前景。

OX40在急性肝衰竭大鼠肝组织中的表达及意义

目的观察共刺激分子(costimulatory molecule)OX40在急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)大鼠肝组织中表达的变化,探讨OX40在急性肝衰竭发病机制中的作用。方法雄性SD大鼠,随机分为正常对照组、急性肝衰竭(ALF)模型组。急性肝衰竭组:腹腔同时注射D-氨基半乳糖(D-GalN)800mg/kg和脂多糖(LPS)8微克/只,在D-GalN和LPS注射后6、12、24、48h 4个时间点留取大鼠血及肝脏标本。全自动生化仪检测血清ALT、AST水平。苏木素-伊红(HE)染色下观察肝组织变化。RT-PCR法检测大鼠肝组织OX40mRNA表达。Western blot法检测肝组织OX40蛋白表达。结果肝衰竭组血清ALT和AST水平在12h升高最明显,24h开始下降。肝衰竭组肝组织OX40mRNA水平至12h达峰值,之后逐渐下降,与对照组比较,各时间点差异具有统计学意义(F=29.970,162.975,62.476,25.124,P<0.05)。肝衰竭组OX40蛋白的表达于12h达到最大值,与对照组相比,差异有统计学意义(F=17.240,169.298,88.289,74.984,P<0.05)。结论 OX40在急性肝衰竭过程中呈上升趋势,于12h达高峰,提示OX40可能在急性肝衰竭过程中发挥重要作用。