脂多糖诱导巨噬细胞中核受体协同抑制因子启动子甲基化对炎症因子的调控作用

目的探讨核受体协同抑制因子(NCOR)在脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞炎症反应中的作用及其调控机制。方法 1μg/ml的LPS分别处理小鼠巨噬细胞RAW264.7 24 h和48 h,应用Western blot和Real time-PCR检测NCOR的表达水平以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)mRNA水平,荧光素酶报告基因检测核因子-κB(NF-κB)的启动子活性。LPS处理细胞48 h后,应用MSP检测NCOR启动子是否发生甲基化以及Western blot检测DNMT3b的表达变化。Real time-PCR检测5'-aza和LPS联合处理细胞后NCOR mRNA的表达水平;转染DNMT3b siRNA后,分别应用Western blot和Real time-PCR检测DNMT3b的表达水平,以及DNMT3b siRNA和LPS联合作用下NCOR、TNF-α、IL-6的表达水平和NF-κB的启动子活性。结果 LPS干预细胞24、48 h后,NCOR蛋白和mRNA表达显著下调(P<0.05),而TNF-α、IL-6 mRNA表达水平、DNMT3b蛋白的表达水平以及NF-κB的启动子活性显著上升(P<0.05)。MSP检测说明LPS可介导NCOR的启动子甲基化。用5'-aza和LPS联合处理细胞后NCOR mRNA水平较LPS组有显著上升(P<0.05)。采用DNMT3b siRNA可显著下调DNMT3b蛋白和mRNA水平,并可部分逆转LPS介导的抑制NCOR表达的效应,抑制TNF-α、IL-6的表达水平和NF-κB的启动子活性(P<0.05)。结论 NCOR启动子的甲基化是LPS介导巨噬细胞炎症反应发生、发展的关键步骤,其可作为治疗ALI/ARDS的潜在靶点。

阻断MAPK通路促进雄激素受体招募NCoR并抑制前列腺癌细胞生长

雄激素受体(androgen receptor,AR)是配体调节的转录因子,与前列腺癌的生长和内分泌治疗密切相关.醋酸环丙孕酮(cyproterone acetate,CPA)作为雄激素的拮抗剂已用于前列腺癌的治疗.结合了CPA的AR可与核受体协同抑制因子作用.已证实丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)可介导生长因子和雄激素受体的信号转导通路的交互作用.我们报道,激活的MAPK抑制结合了CPA的AR招募核受体协同抑制因子(nuclear receptor corepressor,NCoR)至雄激素反应元件上.应用MEK的抑制剂U0126阻断MAPK通路可促进结合了CPA的AR和NCoR相互作用并通过对NCoR的招募增加抑制AR的功能从而阻遏AR靶基因的表达.此外,联合使用CPA和U0126处理稳定表达NCoR的LNCaP细胞可显著抑制前列腺癌细胞的生长.本研究表明,联合应用AR的拮抗剂和MAPK抑制剂有助于前列腺癌的治疗.

人源CDC50基因的分子克隆及在E.coli中的表达

糖皮质激素受体 (GR)为一种特异性配体诱导的转录因子在机体发育、生理及行为等过程中发挥重要作用 .这一过程往往受到转录协同调节因子的控制 ,包括协同抑制因子或协同激活因子的作用 .克隆了人源双跨膜受体分子 ,并命名为hCDC5 0 .该分子编码区有 10 5 6bp ,与鼠源基因mCDC5 0在核苷酸水平有 90 %一致性 .将hCDC5 0蛋白的 16 4～ 317编码序列与GST融合构建原核表达质粒进行重组蛋白的表达与纯化并制备多抗 .用二维双向扩散检测抗体为阳性 ,抗原的滴度为12 5 μg/ml.体外翻译研究显示该基因编码蛋白约为 4 0kD ,与Western检测在动物细胞中的表达一致 .用hCDC5 0真核表达质粒与GR萤光报告系统共转染COS 7细胞显示 ,hCDC5 0对GR信号转导有明显的抑制作用 ,其对GR信号通路的抑制作用达 3～ 4倍以上 .hCDC5 0可能为一个新的协同抑制因子 。