霍乱弧菌毒素协同调节菌毛基因tcpA的克隆及序列分析

目的 以新疆分离 0 13 9霍乱弧菌XJ93 0 0 6株的DNA为模板 ,自行设计引物克隆毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因 (包括侧序列 )并构建重组载体。方法 以 0 13 9霍乱弧菌新疆分离株XJ93 0 0 6基因组DNA作为模板 ;根据O1群E1Tor型霍乱弧菌N16961全基因组序列设计tcpAPCR引物 ,高保真酶扩增tcpA片段 :限制性内切酶切PCR产物和pNEB193空质粒 ,T4DNA连接酶连接酶切产物 ,重组质粒转化大肠杆菌TB1工程菌 ,蓝白斑菌落试验筛选阳性克隆 ;提取质粒经酶切鉴定后测序并利用生物信息数据库对该序列进行序列分析 ,比较。结果 DNA限制性内切酶可从重组质粒pNEB193_tcpA的EcoRⅠ和SalⅠ位点之间切出一个10 3 7bp的DNA片段 ,测序结果与O1群E1Tor型霍乱弧菌N16961、O13 9霍乱弧菌标准株M0 45的tcpA同源性均达到 99 9%以上。结论 成功构建O13 9霍乱弧菌新疆分离株XJ93 0 0 6毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因的重组质粒pNEB193_tcpA ;序列分析表明霍乱弧菌毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因在O1群EITor型霍乱弧菌和O13 9霍乱弧菌中是一类高度保守的原核基因 ,可作为霍乱弧菌疫苗的候选基因。另外为研究O13

霍乱弧菌主要毒力和管家基因序列分析

目的分析广东霍乱弧菌（VC）代表菌株主要毒力基因和管家基因序列。方法PCR扩增霍乱弧菌的主要毒力基因（ctxAB和tcpA）和管家基因（dnaE、hlyA、mdh和recA）、基因测序、对序列进行生物信息学分析。结果不同年代分离的2株埃尔托型（EVC）产毒株和1株0139群VC产毒株的主要毒力基因序列与国内外相关报告比较，ctxA基因及推测的氨基酸序列的同源性分别为99．7％～100％和98．8％～100％．ctxB基因及推测的氨基酸序列的同源性分别为98．8％～100％和96．8％～100％，tcpA基因序列与EVC国际标准株N16961 100％同源。3株产毒株的dnaE、hlyA、mdh和recA基因序列同源性分别为99．8％～100％，100％，99．5％～99．8％和100％，氨基酸序列同源性分别为100％．100％，98．5％～99．3％和100％；3株产毒株和O139群VC非产毒株的管家基因序列同源性分别为97．0％～97．2％，91．8％，94．1％～94．4％，96．9％，氨基酸序列同源性分别为100％，94．6％，94．3％～98．5％和99．7％。结论广东省不同年代EVC产毒株和O139群VC产毒株的群体遗传学关系高度密切，而与O139群VC非产毒株较远，O139群VC产毒株可能起源于EVC产毒株。

霍乱弧菌JS94484株CTX^(EVC)_φ和nct-CTX^(new)_φ基因组变异区序列分析

目的对霍乱弧菌JS94484株CTXEVCφ和nct-CTXnewφ基因组变异区进行序列分析。方法采用聚合酶链反应、基因测序及序列分析。结果JS94484株CTXEVCφ基因组的ig1、rstR、ig2和ctxAB基因与EVC标准株N16961的高度同源。JS94484株nct-CTXnewφ基因组的ig1、rstR和ig2基因,与目前发现的3种类型的同源性均较低,趋异性均较高。CTXEVCφ和nct-CTXnewφ基因组zot基因末端约60bp的基因序列差别较大,推测的氨基酸序列差别也较大。JS94484株的tcpA基因序列与EVC标准株N16961的完全一致。结论霍乱弧菌nct-CTXnewφ基因组的ig1、rstR和ig2基因为新类型,基因功能有待于进一步研究。

霍乱弧菌4种新类型tcpA基因发现及序列分析

目的研究中国霍乱弧菌(VC)毒力协同调节菌毛A亚单位基因(tcpA)的多态性.方法分别进行聚合酶链反应及限制性片段长度多态性分析、型特异引物PCR分型、基因测序及序列分析.结果 200株O1群埃尔托型(EVC)产毒株和100株O139群VC产毒株的tcpA基因均与EVC国际标准株N16961株为同一类型(t2型).50株EVC非产毒株中只有3株携带tcpA基因,1株为t2型,另2株为2种新类型.20株O139群VC非产毒株均不携带tcpA基因.20株非O1非O139群VC中只有2株携带tcpA基因,且为2种新类型.4种新类型tcpA基因与国外发现的4种类型比较,基因序列及推测的氨基酸序列同源性分别为58.3%～77.5%和61.0%～85.5%;5′端约102bp基因序列基本一致,推测的氨基酸序列完全一致;3′端约210bp基因序列变异最大,推测的氨基酸序列变异也最大.抗原表位分析,C末端差异最大.结论建立快速准确区分不同类型tcpA基因的方法,并发现4种新类型.

霍乱弧菌O139和El Tor菌株tcpA分子特征的研究

[目的]从霍乱弧菌XJ93006、MO45、XJ89079中克隆毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因(包括侧序列)并测序比较。[方法]PCR扩增tcpA片段;克隆该片段;提取质粒经鉴定后测序并利用DNAMAN对该序列进行序列分析,比较。[结果]成功构建XJ93006、MO45、XJ89079 tcpA基因的重组质粒。三株霍乱弧菌及与N16961 tcpA基因及其两侧核酸序列同源性XJ89079和N16961为100%,XJ93006和XJ89079为99.8%,XJ93006和MO45为99.5%,XJ89079和MO45为99.7%。[结论]该研究初步认为我国新疆VC O139与本地EVC关系密切。

安徽省淮南市首起0139霍乱弧菌疫情检测分析

目的探讨淮南市首起0139霍乱弧菌疫情的发生原因和生物学特性。方法血清学及常规细菌学方法对菌株进行鉴定，聚合酶链式反应（PCR）检测霍乱毒力基因，改良K—B药敏实验。结果（1）培养分离及血清凝集试验结果，2例患者粪便标本全部阳性，密切接触者6人肛拭子全部阴性；甲鱼塘水样18份，阳性5份；甲鱼产蛋沙场样9份，2份阳性；甲鱼蛋7份，阳性3份；甲鱼排泄物11份，均为阴性。（2）血清凝集试验阳性培养物对头孢哌酮、强力霉素耐药；对氨苄西林、四环素中敏；对氟哌酸、庆大霉素、环丙沙星等敏感。（3）血清凝集试验阳性培养物霍乱毒素（CT）、毒素协同调节菌毛（TCP）全部阳性。结论该起0139霍乱弧菌疫情是因甲鱼养殖塘水污染引起，首例患者分离株与该患者所食甲鱼分离株PFGE带型一致，该菌种对头孢哌酮、强力霉素耐药并携带eta、tcpa毒力基因。

霍乱弧菌新类型TCP氨基酸序列生物信息学分析

目的研究4种新类型霍乱弧菌(VC)毒力协同调节菌毛(TCP)氨基酸序列进行生物信息学特征。方法基因序列及氨基酸序列利用DNAStar和BLAST进行分析。结果对4种新类型tcpA推测的氨基酸序列的α螺旋、β折叠、疏水性、抗原表位等特征进行分析,并与国外发现的4种类型比较,N末端约100个氨基酸序列的抗原表位等特征高度一致,而C末端约60个氨基酸序列的抗原表位等特征差别较大。在对tcpA基因扩增及测序时,扩增片段包括tcpB基因5#端部分基因及其启动子区,序列分析表明,不同类型tcpB的启动子区差别较大,不同类型tcpB5#端部分基因存在多个位点突变,但均未导致氨基酸变异。结论4种新类型TCP和国外发现的4种类型的C末端抗原表位差别较大,保护性抗原表位主要位于C末端,提示不同类型TCP抗原交叉保护性较弱。