追踪随访布鲁菌病患者PCR实验室诊断方法的建立

目的:建立布鲁菌单一PCR实验室检测方法,并在模拟样本和染毒动物实验中优化反应条件,为将PCR方法应用于布鲁菌病患者治疗后的追踪随访提供实验室依据。方法:针对编码BP26的基因序列设计布鲁菌属引物,针对插入性序列IS711设计区分布鲁菌羊种、牛种和猪种引物;以M5或M5荧光菌株为实验组、以PBS为对照组制备系列浓度的模拟样本和染毒动物;用热解法从血液样本中提取布鲁菌基因组;用BP26与羊种、牛种和猪种引物对菌液进行PCR扩增,用BP26和羊种引物对模拟样本和染毒动物不同时间点的血液样本进行检测。结果:菌属水平引物BP26和不同种引物在对布鲁氏菌标准菌株、疫苗株基因组的扩增中均得到特异性条带,具有一定的特异性;热解法可提取到模拟样本和染毒小鼠血液样本中的布鲁菌基因组,经PCR扩增后得到特异性条带;染毒小鼠血样PCR检测阳性结果数随时间先上升后下降,同一时间点增加样本量可提高阳性率,热解法在各时间点检测阳性率均高于同期化学试剂法提取结果,PCR检测方法灵敏度高于分离培养方法。结论:采用热解法提取血液样本中的布鲁菌基因组,易于操作;PCR检测方法安全稳定,敏感性高于传统分离培养方法;以核酸为靶标进行检测的特异性较高,可进一步应用于患者治疗后追踪随访研究。

禽4种常见细菌病多重PCR检测方法的初步研究

为了同时检测鸡金黄色葡萄球菌、鸡志贺氏菌、禽多杀性巴氏杆菌和鸡绿脓杆菌,试验采用单一PCR和多重PCR方法对上述4种病原菌的nu C、ipa H、ptf A和opr L基因进行了扩增,对退火温度进行了优化,检测了单一PCR和多重PCR的特异性和敏感性。结果表明：分别扩增出大小为280 bp、474 bp、150 bp和331 bp的目的基因片段,且单一PCR和多重PCR均未从鸡白痢沙门氏菌、鸡空肠弯杆菌和鸡致病性大肠杆菌中扩增出上述任何一种目的片段;4种病原菌单一PCR的敏感性分别为100 pg/μL、1 pg/μL、1 pg/μL和10 pg/μL,多重PCR中4种病原菌的检出限分别为100 pg/μL、1 pg/μL、10 pg/μL和10 pg/μL。说明试验建立的单一PCR和多重PCR检测方法均具有较好的特异性和较高的敏感性,可快速检测禽类的4种病原菌。

基于多重PCR方法的新疆褐牛乳中乳房炎主要致病菌的检测

为了能同时检测到新疆褐牛乳房炎乳中无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌四种致病菌,试验根据GenBank中的金黄色葡萄球菌nuc、大肠杆菌phoA、无乳链球菌ef-tu和沙门氏菌invA基因保守序列设计了4对特异性引物,提取新疆褐牛77份乳样DNA,采用单一PCR和多重PCR方法进行扩增,统计琼脂糖凝胶电泳结果并计算相应感染率,比较两种检测方法的符合率,并检测多重PCR方法在牛场中的应用效果。结果表明:单一PCR方法中以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染为主,感染率分别为93.5%和76.6%。多重PCR方法中,以大肠杆菌+金黄色葡萄球菌+无乳链球菌的混合感染为主,感染率为24.7%;其次是大肠杆菌+金黄色葡萄球菌的混合感染,感染率为16.9%。对两种检测方法的结果进行比较,大肠杆菌+金黄色葡萄球菌+无乳链球菌及大肠杆菌+金黄色葡萄球菌混合感染的符合率分别为95%和93%;大肠杆菌+沙门氏菌+无乳链球菌的混合感染符合率为0,但多重PCR检出数量仅有2份;其余致病菌混合感染的符合率为100%。结合牧场的DHI报告及兽医诊断确认新疆褐牛中的乳房炎主要致病菌为大肠杆菌的单一感染和无乳链球菌+大肠杆菌的混合感染,感染率分别为53.8%、30.8%。说明该多重PCR方法可用于新疆褐牛乳房炎的诊断。

多重PCR法检测5种动物源性成分的适用性验证

为了探索新建立的一种多重PCR对动物源性食品检测的适用性,实验采用猪、牛、羊、鸡和鸭肉混合的方法,用多重PCR对混合肉样进行检测,以验证多重PCR的检测的可行性和有效性。通过对市售20种样品提取DNA进行多重PCR和单一PCR的5种动物源性成分检测结果比对,进一步比较两种方法检测结果的不同。结果表明,建立的多重PCR可同时检测出2种、3种、4种和5种动物源性成分,采用多重PCR法和单一PCR法对20种市售样品分别检测,两种方法结果无差异,表明所建立的多重PCR法可检测猪、牛、羊、鸡和鸭5种动物源性成分。