类风湿关节炎患者外周血单个核淋巴细胞IL-21受体表达及意义

[目的]检测类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核淋巴细胞表面IL-21受体(IL-21R)表达,探讨其在疾病发生过程中的免疫病理作用。[方法]收集26例RA患者和18例健康成人对照外周血标本,分离外周血单个核淋巴细胞,利用流式细胞仪检测IL-21R在外周血CD4+、CD8+T细胞、B细胞和NK细胞表面表达,分析它们在疾病发展过程中的作用。[结果]RA患者外周血CD4+、CD8+T细胞、B细胞和NK细胞表达IL-21R水平比健康者比较显著升高(P﹤0.05)。RA患者接受有效的药物治疗,待症状控制后,分析发现RA患者外周血CD4+、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞IL-21R水平呈明显下降(P﹤0.05)。[结论]RA患者外周血单个核淋巴细胞表达IL-21R水平明显升高,提示IL-21R在关节炎症病变过程中起着重要作用,可能诱导关节滑模炎症病变,参与关节滑膜组织及全身免疫病理损伤。

外周血单个核淋巴细胞表面IL-21受体表达与类风湿关节炎的相关性

目的探讨外周血单个核淋巴细胞表面IL-21受体(IL-21R)在类风湿关节炎(RA)发生过程中的作用。方法收集32例RA患者(观察组)和22例健康成人(对照组)外周血标本,分离外周血单个核淋巴细胞,采用流式细胞仪检测CD4+、CD8+细胞、B细胞和NK细胞表面IL-21R的表达。结果观察组IL-21R表达水平明显高于对照组(P<0.05)。药物治疗症状控制后,IL-21R表达水平明显下降(P<0.05)。结论RA患者外周血单个核淋巴细胞表达IL-21R水平明显升高,提示IL-21R在RA的病情进展中起重要作用,其机制可能为诱导关节滑膜炎症病变、参与关节滑膜组织及全身的免疫病理损伤。

检测外周血单个核淋巴细胞IL-21受体表达与类风湿关节炎的关系探讨

目的:探讨类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核淋巴细胞表面IL-21受体(IL-21R)表达的检测在RA发生过程中的免疫病理作用。方法:收集32例RA患者和22例健康成人外周血标本,分离外周血单个核淋巴细胞,利用流式细胞仪检测在外周血CD4+、CD8+T细胞、B细胞和NK细胞表面IL-21R的表达,分析它们在疾病发展过程中的作用。结果:RA患者外周血CD4+、CD8+T细胞、B细胞和NK细胞表面IL-21R的表达水平与健康者比较呈显著升高(P<0.05)。在接受药物治疗症状控制后,再检测RA患者外周血CD4+、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞IL-21R的表达水平呈明显下降(P<0.05)。结论:外周血单个核淋巴细胞表达IL-21R水平在RA患者中明显升高,提示IL-21R在关节炎症的病变过程中可能诱导关节滑膜炎症病变、参与关节滑膜组织及全身的免疫病理损伤作用。

慢性乙型肝炎患者外周血单个核淋巴细胞不同洗涤方法对HBVDNA检测的影响

目的 :慢性乙型肝炎患者外周血单个核淋巴细胞 (Peipheralbloodmononuclearcells,PBMC)不同洗涤方法对HBVDNA检测的影响。方法 :淋巴细胞分离液常规密度梯度法分离 1例血清HBVDNA阳性慢性乙型肝炎患者PBMC后 ,分别采用常规洗涤法和改良洗涤法 (后者即在常规洗涤法的基础上第 2、 4次洗涤前不重悬细胞 ,直接加入洗液后离心 ) ,计算细胞收获得率和细胞存活率 ,荧光定量PCR法检测 1、 3、 5次洗液样本和细胞样本的HBVDNA ,重复实验 3次。结果 :常规法第 1、 3、 5次洗液样本HBVDNA均阳性 ,改良法洗涤 5次后洗液样本HBVDNA均阴性 ;改良法洗涤的细胞得率和细胞存活率分别为 95 %和 98% ,常规法洗涤的细胞得率和细胞存活率分别为 71%和 83% ;不论常规洗涤法和改良洗涤法收获的PBMC均可检出HBVDNA。结论 :慢性乙型肝炎患者PBMC改良洗涤法优于常规洗涤法 ,适用于PBMC中HBVDNA荧光定量PCR检测。

急性胰腺炎患者外周血单个核淋巴细胞IL-21受体表达及意义

目的分析急性胰腺炎(AP)患者外周血单个核淋巴细胞表面IL-21受体(IL-21R)表达,探讨其在疾病发生过程中的免疫病理作用。方法收集72例AP患者(其中轻型AP52例,重症AP20例)和40例正常健康人外周血标本,分离外周血单个核淋巴细胞,利用流式细胞仪检测IL-21R在外周血CD4+、CD8+T细胞、B细胞和NK细胞表面的表达水平,分析它们在疾病发展过程中的作用。结果AP患者外周血CD4+、CD8+T细胞、B细胞和NK细胞表达IL-21R水平比健康者比较显著升高(P<0.05),其中重症AP患者上述细胞IL-21R水平显著高于轻型AP患者。结论IL-21R在AP患者外周血单个核淋巴细胞表达升高,并与病情严重程度具有相关性,提示IL-21R参与胰腺急性炎症损伤过程。

基于单个B淋巴细胞扩增技术筛选马传染性贫血病毒的囊膜蛋白单克隆抗体

马传染性贫血病毒(EIAV)囊膜蛋白(Env)是参与病毒感染过程中的关键蛋白,由表面蛋白(Gp90)及跨膜蛋白(Gp45)组成,Env蛋白在介导病毒粘附、细胞间融合、疾病传播等方面发挥重要作用。为了通过单个B淋巴细胞扩增技术获得Env特异性单克隆抗体(MAb),本研究利用密码子优化后的Gp90基因构建了重组质粒pcDNA3.1-s-gp90-His,按常规方法将该重组质粒免疫小鼠6次后分离脾细胞,利用荧光激活细胞分选(FACS)技术分离免疫小鼠脾细胞中可识别Gp90的单个B淋巴细胞,结果显示,本研究从2×10^(8)个小鼠脾细胞中获得890个识别Gp90的单个B淋巴细胞。通过特异性引物以单个B淋巴细胞的基因组cDNA为模板扩增抗体重链(Ig VH)和轻链(Ig VL)的可变区基因,利用重叠延伸PCR方法分别将重链(Ig VH)和轻链(Ig VL)可变区基因克隆至pcDNA3.1中,测序鉴定结果显示分别正确构建了27对匹配的pcDNA3.1-VH和pcDNA3.1-VL表达质粒,将这27对匹配的表达质粒分别按照pcDNA3.1-VH:pcDNA3.1-VL=1:1的比例共转染至HEK293F细胞,收获细胞上清,经Protein A纯化获得Gp90 MAb。通过ELISA和western blot两种方法对纯化的Gp90 MAb进行鉴定,结果显示获得了27株可匹配的抗体基因对,经表达后有4株MAb可与Gp90蛋白结合,且可以识别Gp90蛋白的天然构象。本研究首次采用单个B淋巴细胞扩增技术对Gp90 MAb进行了筛选,获得的Gp90 MAb为Env蛋白检测方法的研究提供了物质基础,同时为深入研究Env蛋白的功能奠定了基础。

二重二次PCR对外显子缺失型DMD患者单淋巴细胞遗传学诊断的研究

目的对已知dystrophin基因50号外显子缺失的Duchenne型肌营养不良(Duchennemusculardystrophy,DMD)患者及正常对照者进行单个淋巴细胞遗传学诊断,建立该病单细胞植入前遗传学诊断(preimplantationgeneticdiag-nosis,PGD)方法,为携带者夫妇进行植入前遗传学诊断以提供细胞学基础。方法在解剖显微镜下获取已经确诊为dys-trophin基因50号外显子缺失型DMD患者和正常对照者的单个淋巴细胞,采用dystrophin基因50号外显子引物/SRY基因引物二重二次PCR的方法进行遗传学诊断。结果男性患者单个淋巴细胞中SRY基因阳性同时50号外显子阴性的比例为92%;正常男性对照中SRY基因和50号外显子均阳性的比例为91%;正常女性对照中50号外显子阳性和SRY基因阴性的比例为93%。结论通过二重二次PCR能够进行dystrophin基因50号外显子缺失型DMD患者和正常对照的单个淋巴细胞遗传学诊断,为PGD技术在该病遗传学诊断中的应用打下基础。

单个B细胞抗体制备技术及其在肝脏疾病中的应用

单克隆抗体是具有高度特异性的抗体,目前已广泛应用于多种疾病,尤其是在各种病毒引发的肝损伤的治疗和研究中,显示出了不可替代的作用。近年来基于单个B淋巴细胞直接制备的人源性单克隆抗体具有抗原特异性高、免疫原性低及安全高效等优点,越来越受到瞩目。随着单克隆抗体技术和PCR技术的不断改进,单个B淋巴细胞抗体制备技术也有了很大发展。尽管由单个B淋巴细胞产生作用于肝脏的单克隆抗体的相关报道并不多见,但其在肝脏疾病的治疗和研究中展现出了广阔的应用前景。简述了单个B淋巴细胞抗体制备技术的研究进展及单个B淋巴细胞制备的抗体在肝脏疾病中的应用。

重症感染性休克外周血单个核细胞TLRs信号通路变化

目的 探究重症感染性休克患者外周血单个核细胞(PBMCs)Toll样受体(TLRs)信号通路及细胞免疫炎症因子变化。方法选取2017年1月一2021年1月武汉市第一医院收治的101例重症感染性休克患者为研究组,根据患者人住重症监护病房(ICU)后28d内预后情况分为病死组33例和生存组68例,另外选取同期体检的120名健康体检者为对照组,采集重症感染性休克患者感染部位分泌物及血液标本进行病原菌鉴定,比较研究组和对照组以及病死组和生存组PBMCs中TLRs信号通路相关因子TLR2mRNA、TLR4mRNA、核因子κB(NF-κB)表达、外周血T淋巴细胞亚群以及炎症因子水平差异。结果101例重症感染性休克患者共分离得到病原菌117株,其中革兰阴性菌占68.38%;研究组PBMCs中TLR2mRNA、TLR4mRNA、NF-κB表达及外周血CD_(4)^(+)、白细胞介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平高于对照组(P<0.05),CD_(3)^(+)、CD_(4)^(+)、CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)、IL-10、干扰素-γ(IFN-γ)水平低于对照组(P<0.05);病死组PBMCs中TLR2mRNA、TLR4mRNA、NF-κB表达及外周血CD_(8)^(+)、IL-4、TNF-α水平高于生存组(P<0.05),CD_(3)^(+)、CD_(4)^(+)、CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)、IL-10、IFN-γ水平低于生存组(P<0.05)。结论重症感染性休克感染的病原菌以革兰阴性菌为主,TLRs信号通路异常激活、免疫抑制以及炎症反应加重与重症感染性休克及其预后密切相关。

IL-21受体在溃疡性结肠炎中的表达及对促炎症细胞因子分泌的诱导作用

目的:探讨IL-21对UC患者外周血和肠黏膜固有层组织内淋巴细胞的免疫病理调节.方法:收集28例UC患者和22例健康成人外周血标本和肠黏膜活检标本,分离外周血单个核淋巴细胞(PBMC)和肠黏膜固有层单个核淋巴细胞(LPMC),利用流式细胞仪检测IL-21R在CD4+、CD8+T细胞、B细胞和NK细胞表面表达.培养PBMC和LPMC,使用IL-21和抗CD3单抗体外刺激,48h后收集上清液,使用ELISA检测促炎症细胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-2)分泌,分析IL-21在疾病发展过程中的免疫病理作用.结果:UC患者外周血和肠黏膜固有层组织内CD4+、CD8+T细胞、CD20+B细胞和CD56+NK细胞表达IL-21R水平比健康者显著升高(PBMC:8.42±2.14vs3.46±0.54,10.35±2.17vs5.28±2.2,7.27±1.15vs2.35±0.41,12.55±3.12vs5.45±1.06;LPMC:22.44±3.46vs6.26±1.15,24.48±4.57vs6.87±1.02,16.24±3.10vs5.56±1.44,23.54±4.12vs8.45±1.68,均P<0.05).体外培养PBMC或LPMC,使用IL-21刺激,发现IL-21可显著诱导UC患者的PBMC和LPMC激活,并分泌高水平的TNF-α和IFN-γ(346±72vs120±27,3048±426vs1182±242;625±113vs154±35,3827±418vs1520±304,均P<0.05).结论:IL-21R参与肠黏膜炎症损伤,阻断IL-21生物学效应可能治疗UC的发生.

应用荧光聚合酶链反应对α地中海贫血进行植入前遗传学诊断

目的探讨应用跨越断裂点荧光聚合酶链反应(PCR)技术在α地中海贫血(简称α地贫)植入前遗传学诊断(PGD)中的应用。方法获取α地贫东南亚缺失型携带者单个淋巴细胞,建立了稳定的单细胞跨越断裂点荧光PCR检测技术,并对4对夫妇双方均为α地贫———SEA缺失型杂合子应用荧光PCR进行了α地贫的PGD。结果单个淋巴细胞平均扩增效率为90.0%(72/80),平均等位基因脱扣(ADO)率为8.3%(6/72)。对4对夫妇进行4个周期PGO,共检测38个胚胎,获得38个卵裂球,其中34个卵裂球扩增成功,扩增效率为89.5%(34/38),ADO率为5.9%(2/34)。经PCR分析,共获得11个正常胚胎,8个杂合子胚胎,15个重型地贫胚胎。移植了11个胚胎,获得2例临床妊娠。孕17周时经脐带血穿刺,分别证实为完全正常胚胎和杂合子胚胎,现已出生两名健康男婴。结论应用单细胞荧光PCR技术可对ɑ地贫进行植入前遗传学诊断,达到优生的目的。

多重巢式聚合酶链反应在β地中海贫血植入前遗传学诊断中的应用

目的探讨应用多重巢式聚合酶链反应(PCR)技术在β地中海贫血(简称β地贫)植入前遗传学诊断(PGD)中的应用。方法获取β地贫基因携带者单个淋巴细胞,建立了稳定的单细胞多重巢式PCR检测技术,可同时检测β珠蛋白基因及与β珠蛋白基因紧密连锁的HumTHO1基因,并对4例已出生的重型β地贫患儿及双方均为β地贫基因携带者的夫妇应用多重巢式PCR进行了β地贫的PGD。结果利用单细胞多重巢式PCR,可以同时检测中国人常见的16种β地贫突变类型,单个淋巴细胞平均扩增效率为91·3%,平均等位基因脱扣(ADO)率为17·0%。对4对夫妇进行4个周期PGD,共活检33个胚胎,获得33个卵裂球,其中30个卵裂球扩增成功,扩增效率为90·9%,ADO率为13·3%。26个胚胎经PCR分析后获得明确诊断,移植了8个胚胎,获得1例临床妊娠。孕17周时经脐带血穿刺,证实为完全正常胚胎,现已出生1名正常女婴。结论应用单细胞多重巢式PCR技术可对β地贫进行植入前遗传学诊断,达到优生目的。

相对定量检测HIV/AIDS病人PBMCs中TIGIT mRNA表达水平的方法建立

目的建立检测人外周血单个核淋巴细胞（PBMCs）中T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域（TIGIT）信使核糖核酸（mRNA）表达水平的相对定量方法,并探讨TIGIT在艾滋病病毒（HIV）感染者/艾滋病（AIDS）病人（简称HIV/AIDS病人）临床监测中的意义。方法设计基因TIGIT引物3对,并利用超声波-煮沸法提取人PBMCs总RNA,选用管家基因GAPDH作为内参,然后用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）进行反转录及扩增TIGIT基因。利用软件测定电泳条带的灰度值（IOD）,计算TIGIT mRNA的相对表达量。结果超声波-煮沸法提取的RNA纯度（A260/A280=1.71±0.056）优于超声波法（A260/A280=1.51±0.023）和煮沸法（A260/A280=1.375±0.078）;筛选出扩增条带清晰且单一的TIGIT引物;相对定量结果表明,TIGIT mRNA在HIV/AIDS病人中的相对表达量均数（0.520 4±0.067）显著低于健康人群（1.383±0.093）,差异有统计学意义（t=7.206,P=0.0167）。结论所建立的相对定量RT-PCR检测方法具有成本低、简单易行的优点,可应用于检测HIV/AIDS病人外周血中TIGIT mRNA的表达差异。

73例HIV/AIDS抗逆转录病毒治疗患者PBMCs中miR-221和miR-29及miR-155水平变化

目的 规律服药人获得性免疫缺陷病毒/艾滋病(HIV/AIDS)患者外周血单个核淋巴细胞(PBMCs)中微小核糖核酸-221(miR-221)、miR-29、miR-155水平与抗逆转录病毒治疗(HAART)疗效的关系。方法 选择杭州市临平区第一人民医院感染科2019年1月-2021年1月接受HAART治疗的HIV/AIDS患者73例为研究组,选择同期体检健康人73名为对照组。对照组于体检当天,研究组HIV/AIDS患者于开始HAART治疗前、HAART治疗3个月、6个月和12个月复查时抽取外周静脉血3份,一份使用荧光定量扩增系统检测外周血RNA中HIV-1病毒载量,另一份采用流式细胞术外周血中CD_(4)^(+)T淋巴细胞细胞计数,第三份采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测PBMCs中miR-221、miR-29、miR-155含量。结果 研究组PBMCs中miR-221、miR-29、miR-155高于对照组(P<0.05);研究组不同时间点miR-221、miR-29、miR-155及CD_(4)^(+)T细胞计数和HIV病毒载量差异具有统计学意义(P<0.05),随着治疗时间的延长miR-221、miR-29、miR-155、HIV病毒载量逐渐下降,CD_(4)^(+)T细胞计数逐渐上升(P<0.05);治疗失败组患者PBMCs中miR-221、miR-29、miR-155和HIV病毒载量高于非治疗失败组,CD_(4)^(+)T细胞计数低于非治疗失败组(P<0.05);miR-221、miR-29、miR-155及HIV病毒载量两指标间均成正相关,miR-221、miR-29、miR-155及HIV病毒载量与CD_(4)^(+)T细胞计数均成负相关。结论 miR-221、miR-29、miR-155在一定程度上可反映HAART临床疗效,在临床中可辅助应用。