单克隆培养法分离、培养胶质瘤干细胞

目的观察单克隆培养法从人脑胶质瘤细胞系SHG44中分离、培养肿瘤干细胞的结果。方法取对数生长期SHG44细胞,用无血清培养基进行肿瘤干细胞的分离培养及单克隆培养,免疫荧光染色法对分化前后的肿瘤球行CD133、神经巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白质(GFAP)、小管蛋白β-Tubulin染色,MTT法检测肿瘤干细胞的增殖情况,流式细胞术检测CD133阳性细胞比例。结果单克隆分离培养的细胞球表达CD133及Nestin干细胞标记物,分化后表达星形胶质细胞GFAP及神经元β-Tubulin标记物,细胞球生长约第5天增殖率达到峰值。结论单克隆培养法可成功分离培养出胶质瘤干细胞,分化前后的细胞球可表达干细胞标记物、神经胶质细胞及神经元标记物,肿瘤球具有较强的增殖及分化能力,并含有一定数量的CD133阳性细胞。

骨髓基质干细胞的单克隆化培养和多向分化的实验研究

目的通过对骨髓基质干细胞(marrow stromal cells,MSCs)的单克隆化培养、鉴定和扩增,获得从一个单细胞扩增出的大量均质MSCs,并研究其多向分化能力。方法无菌条件下获取大鼠骨髓细胞,在培养的过程中挑出相应的单细胞克隆。将挑出的单细胞克隆与饲养细胞混合培养,快速进行扩增和细胞表面标志的鉴定,并进一步行增殖和细胞分化实验。结果在含有特定饲养层细胞的培养条件下,单克隆来源的MSCs能在抑制分化的状态下大量扩增,并保持细胞的均质性;而且在这种培养条件下,MSCs的增殖能力明显增强,并能成功被诱导向软骨、神经样细胞分化。结论通过骨髓细胞的单克隆培养,获得了均质和多向分化潜能的MSCs,为进一步更精确的研究MSCs的生物学特性提供了基础。

草履虫单克隆培养种群增长趋势比较研究

【目的】筛选行之有效的草履虫(Paramecium)单克隆培养方法。【方法】结合形态学与SPSS统计学方法对7种单克隆培养方法下的草履虫种群增长趋势进行比较研究。【结果】采用稻草培养法、大米培养法、莴笋叶榨出汁培养法、熟鸡蛋黄培养法、马铃薯培养法、玉米培养法、酸奶培养法等不同草履虫单克隆培养法培养的草履虫在单克隆培养过程中存在明显的时空量化关系及与之相关联的生殖方式。【结论】马铃薯培养法培养效果最差,而莴笋叶榨出汁培养法培养效果最好;生殖方式直接影响草履虫的种群增长趋势。草履虫的单克隆培养不仅应该选择行之有效的方法,还应掌握虫体在培养过程中的时空量化关系,以保证对草履虫材料的足量需求。

人骨髓基质干细胞的单细胞克隆培养与鉴定

背景:骨髓基质干细胞缺乏特异的表面识别分子,其鉴定一直是研究中的难题。目的:探索人骨髓基质干细胞培养条件,获得体外克隆化培养的成人骨髓基质干细胞,并对其进行表型分析及分化潜能鉴定。方法:外科手术取髂骨术中抽取骨髓,采用密度梯度离心法初步分离骨髓基质干细胞,用极限稀释法进行克隆化培养;流式细胞仪对克隆化培养的骨髓基质干细胞进行细胞表面标志检测,并进行体外成软骨、成骨及心肌细胞诱导,免疫组织化学及RT-PCR检测成软骨、成骨及心肌细胞表达,确定其表型及分化潜能。结果与结论:单个细胞来源骨髓基质干细胞在体外1:3传代一般可以传28代左右,24代以前生长状态良好;经流式细胞仪检测,骨髓基质干细胞表达CD29,CD44,CD106,不表达CD14,CD34,CD45,HLA-DR;骨髓基质干细胞体外可向成骨、成软骨及心肌细胞分化,提示体外克隆化培养的骨髓基质干细胞能维持良好的成体干细胞生物学特性。

人小涎腺成纤维样单克隆细胞的成骨分化

目的:探索人小涎腺成纤维样单克隆细胞的体外培养、扩增方法,鉴定其性质,研究向成骨细胞分化的潜能。方法:组织块贴壁法原代培养人小涎腺细胞,收集成纤维样细胞,用96孔板稀释铺板法克隆培养,免疫荧光和RT-PCR检测细胞表型,并进行成骨诱导分化,通过骨钙素、一型胶原免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶、茜素红钙结节染色鉴定成骨分化。结果:成功的在体外扩增培养出人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫荧光证实细胞表达CD13、CD29、CD106和CD44,RT-PCR显示CK18、α-SMA、vimentin、CD106、nestin基因表达与人骨髓间充质干细胞相似。成骨诱导8天后,碱性磷酸酶表达阳性率100%,19天后骨钙素和一型胶原大量表达,并形成钙结节。结论:所建立的分离培养体系能够获得大量人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫表型类似于间充质干细胞。在成骨诱导培养条件下具有良好的向成骨细胞分化的潜能。

成年大鼠骨髓多能成体祖细胞的克隆化培养及其鉴定

目的优化培养条件,获得体外克隆化培养的成年大鼠骨髓多能成体祖细胞(rMAPC),并对其进行表型分析及分化潜能鉴定。方法选择低血清条件培养基全骨髓直接贴壁法初步分离大鼠骨髓干细胞,用极限稀释法进行克隆化培养;用流式细胞术及免疫细胞化学法对克隆化培养的 rMAPC 进行表型分析,并进行体外成脂肪、成骨及成神经细胞诱导,RT-PCR 检测 Oct 4及三个胚层早期标志物,确定其表型及分化潜能。结果单个细胞来源 rMAPC 在体外扩增至20代仍保持良好的生长状态;流式细胞术及细胞免疫组化检测结果显示 CD71、α-SMA 及 Vimentin 表达阳性;CD34、CD44、CD45表达阴性;细胞周期分析显示 S+G_2+M 期细胞约占17%,而处于 G_0/G_1期的细胞占83%:rMAPC 体外可被诱导向脂肪细胞、骨细胞及神经细胞分化;RT-PCR 检测到 Oct 4及三个胚层早期标志物的表达。结论体外克隆化培养的 rMAPC 能维持良好的干细胞生物学特性。

大鼠纤维环干细胞的分离与鉴定

目的:分离纯化大鼠纤维环干细胞并观察其集落形成能力及多向分化潜能。方法:运用单克隆培养法分离纯化纤维环干细胞,倒置显微镜下观察干细胞集落,结晶紫染色显示细胞集落形态,成骨、成软骨及成脂肪诱导鉴定其纤维环干细胞的多向分化潜能。结果:单克隆培养法可以纯化分离出活性较好的纤维环干细胞。经过8~10 d培养,倒置显微镜下可观察到单克隆细胞集落,结晶紫染色后可肉眼见广泛细胞集落,经过体外三系诱导分化后,证实纤维环干细胞具有较强的三系分化潜能。结论:大鼠纤维环组织存在典型的大鼠纤维环干细胞。

青岛海边数种螺旋藻(Spirulina spp.)的分类研究

本文描述了从青岛海边分离的数种螺旋藻的形态与分类 按照文献[1][2][3][4][5][6][7][8][9]标准种形态的描述,本研究室藻种号MACC/Y146被定为Spirulina versicolor,MACC/Y171被定为S.subtilissima,MACC/Y38被定为S.subsalsa,MACC/Y133被定为Spirulina sp.其中MACC/Y146,MACC/Y133我国尚未报导

TALENs介导的CCR5△32/△32突变赋予CD4^+U87细胞抵抗HIV-1感染的能力

CCR5Δ32/Δ32(CC chemokine receptor type 5,CCR5)基因型的骨髓干细胞移植,可以治愈感染人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的患者。本研究运用TALENs结合同源重组技术产生纯合子的CCR5△32/△32突变,并赋予CD4^+ U87细胞抵抗HIV-1感染的能力。首先,采用重叠延伸PCR合成CCR5△32 donor DNA。构建CCR5-TALENs和CCR5△1-TALENs质粒,将CCR5-TALENs及CCR5△1-TALENs质粒分别结合CCR5△32 donor DNA,共转染野生型CD4^+ U87细胞。其次,用T7E1酶切分析转染后的TALENs和CCR5△1-TALENs打靶效率。通过单克隆培养筛选CCR5△32/△32突变的单克隆细胞。最后,将CCR5△32/△32 CD4^+ U87细胞和野生型CD4^+ U87细胞进行Bal HIV-1病毒攻击实验,采用ELISA方法检测上清中P24抗原含量。测序结果表明,通过重叠延伸PCR成功获得1 602 bp CCR5△32 donor DNA;CCR5-TALENs质粒第1轮、第2轮和第3轮转染,打靶效率分别为14.80%, 38.20%和50.40%;从29个单个细胞培养的克隆中成功筛选出1个CCR5△32/△1基因型CD4^+ U87细胞,CCR5与CCR5△32 donor DNA之间同源重组效率为1.7%;CCR5△1-TALEN质粒第2轮转染,打靶效率为23.5%,从34个单细胞培养的克隆中筛选出3个CCR5△32/△32基因型CD4^+ U87细胞,CCR5与CCR5△32 donor DNA之间同源重组效率达到8.8%。Bal HIV-1攻击实验表明,野生型CD4^+ U87细胞培养上清第2、4、6、8、10、12 d,平均P24抗原含量分别为58.47±2.35、162.23±4.78、458.78±27.34、613.35±26.78、580.35±24.73、483.34±30.85 pg/mL。而CCR5△32/△32基因型CD4^+U87细胞的培养上清平均P24抗原含量分别为11.30±1.76、5.13±0.88、3.43±0.44、3.84±0.69、3.21±0.44、4.24±0.46 pg/mL。本研究表明,TALENs结合同源重组技术无缝隙地介导了CCR5△32/△32突变,并赋予了CD4^+ U87细胞抵抗HIV-1感染的能力。

纤维环来源间充质干细胞的特点及提纯筛选法的研究进展

纤维环是椎间盘结构的重要组成部分,在椎间盘正常解剖结构及维持脊柱生物力学稳定性中发挥重要作用。纤维环细胞的损伤与凋亡是引起椎间盘退变的主要原因之一。现今生物学修复纤维环的主要方法有基因工程、细胞移植及组织工程等。已有研究表明,可以从纤维环组织中提取获得纤维环来源间充质干细胞(AFMSC),但因取材困难,退变纤维环提取的干细胞活力较差等问题,一定程度上限制了其应用。本文就AFMSC增殖特点、分化特点、分离提纯方法的研究进展作一综述。