甲状腺相关眼病治疗中不同单克隆抗体有效性与安全性的系统评价再评价

目的:全面评估甲状腺相关眼病(thyroidassociated ophthalmopathy,TAO)治疗中利妥昔单克隆抗体(rituximab,RTX)、托珠单克隆抗体(tocilizumab,TCZ)、替妥木单克隆抗体(teprotumumab,TMB)的有效性和安全性。方法:采用系统评价再评价方法,系统检索PubMed、Embase、Cochrane Library数据库中关于TAO治疗的系统评价/Meta分析,检索时间均为建库至2024年1月。分别采用PRISMA 2020声明、AMSTAR 2量表和GRADE工具评估纳入研究的报告质量、方法学质量及证据质量。结果:当前关于TAO治疗中3种单克隆抗体的系统评价在报告规范性、方法学质量和证据质量方面仍存在不足。目前仍缺少3种单克隆抗体直接比较的证据,基于间接比较证据,TCZ可能是最好的治疗方法,其次为TMB和RTX。有效性方面,TCZ、TMB可显著降低临床活动性评分、眼球突出度及生活质量,TCZ显著降低复视发生,RTX显著降低疾病应答,RTX及TCZ显著改善疾病失活率,RTX在复视、眼睑裂变化、NOSPECS评分与生活质量方面无显著差异。安全性方面的结论尚不一致,TCZ和TMB可能增加不良事件的发生率,而RTX在安全性方面与糖皮质激素或安慰剂相比无显著差异。结论:本研究为TAO治疗中3种单克隆抗体的选择提供循证依据。尽管TCZ在有效性方面可能具有优势,但考虑到现有证据的限制性,未来仍需更多高质量研究进一步验证和比较不同单克隆抗体在TAO治疗中的有效性和安全性。

抗IgE单克隆抗体联合变应原特异性免疫治疗的应用进展

抗IgE单克隆抗体目前已被批准用于治疗哮喘和慢性荨麻疹,同时抗IgE单克隆抗体联合变应原特异性免疫治疗(AIT)作为过敏性疾病的辅助治疗已引起普遍关注。研究表明,在AIT治疗中或治疗前添加抗IgE单克隆抗体可显著减少AIT不良反应的发生频率和严重程度,明显改善症状评分,缩短达到维持剂量所需的时间。目前仍需要更大规模的高质量对照试验更好地识别抗IgE单克隆抗体联合AIT的获益人群,以及治疗最佳剂量和持续时间,并评估长期效益、进行成本-效益分析。本文就抗IgE单克隆抗体在AIT中作为辅助治疗的应用进展进行综述。

半固体培养法制备非洲猪瘟病毒pA104R蛋白的单克隆抗体

为了快速、高效制备非洲猪瘟病毒(ASFV)单克隆抗体,本研究通过大肠杆菌系统表达并纯化了ASFV重组蛋白pA104R。以ASFV重组蛋白pA104R为抗原,分别比较了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂和常规弗氏佐剂两种免疫策略,并重点比较半固体培养法和常规有限稀释法来制备ASFV pA104R单克隆抗体的效率。结果显示,本研究获得了相对分子质量为3.5×104的ASFV重组可溶性蛋白pA104R,通过其与CpG ODN联合氢氧化铝佐剂免疫小鼠,在第21 d即可达到融合要求,本试验方法(重组蛋白pA104R与CpG ODN联合氢氧化铝佐剂免疫)较重组蛋白pA104R与常规弗氏佐剂免疫节省14 d时间。通过半固体培养法筛选单克隆的试验周期比有限稀释法缩短28 d,并减少了亚克隆的工作量。半固体培养法获得5株阳性杂交瘤细胞,挑选效价较高的3株(9A4、9H6、11F5)进行鉴定,重链均为IgG,轻链均为KAPPA。纯化后的3株单克隆抗体针对pA104蛋白和全病毒蛋白质的效价分别达1∶160000~1∶320000和1∶200~1∶400。本研究优选了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂结合半固体培养法筛选pA104R的单克隆抗体,为单克隆抗体制备提供了快速高效的新策略。

狂犬病暴露后预防性单克隆抗体药物研究进展

简要介绍狂犬病的流行现状、发病机制、狂犬病病毒G蛋白中和抗原位点及其单克隆抗体的中和机制。重点介绍目前全球已上市或处于研发阶段的多种狂犬病病毒单克隆抗体药物的筛选发现技术、识别位点、作用方式以及体内外病毒中和效果,分析上述单克隆抗体在目前狂犬病暴露后治疗的应用推广中存在的问题,并针对当前狂犬病免疫球蛋白存在的血源供应、中和效价、质量控制及潜在病毒感染等问题,指出狂犬病病毒单克隆抗体研发的重要性,尤其是抗体的中和效价和中和广度,进而提出针对狂犬病病毒遗传谱系Ⅱ/Ⅲ的全人源单克隆抗体开发,以及针对G蛋白多个抗原位点的单克隆抗体鸡尾酒(mAb cocktail)疗法是当前在狂犬病暴露后预防性单克隆抗体药物研发中亟待解决的问题。

猪细小病毒4型单克隆抗体制备及抗原表位鉴定

为了制备猪细小病毒(PPV)4型Cap蛋白单克隆抗体(mAb)并鉴定其抗原表位,试验采用原核表达的Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与SP2/0细胞进行融合,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、血凝抑制(HI)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选阳性克隆,最终获得2E7、4D6和5C9这3株特异性杂交瘤细胞株;然后用mAb对Cap蛋白多肽进行ELISA检测,鉴定分析其抗原表位。结果显示:4D6和5C9 mAb识别表位为线性表位,分别为387RRQDN^(391)和578QRKE^(581),而2E7 mAb识别的表位为构象表位;通过对Cap蛋白3D结构定位分析,387RRQDN^(391)和578QRKE^(581)抗原表位位于蛋白表面,且在PPV4亚型中高度保守,而与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)和猪博卡病毒(PBoV)基因序列同源性低。本研究为PPV4诊断试剂的开发和新型疫苗的研制提供了参考。

抗H7N9流感病毒的单克隆抗体与胃组织的交叉反应研究

目的筛选鉴定与胃组织交叉反应的抗H7N9流感病毒的单克隆抗体,初步探讨流感病毒感染会引发肠道相关疾病的可能致病机制。方法利用H7N9流感病毒制备了大量的单克隆抗体,对制备的单克隆抗体运用ELISA方法进行亚型和效价测定,免疫组化对制备的单克隆抗体与组织的反应性进行筛选,巢式PCR分子生物学技术克隆单克隆抗体轻重链可变区序列。结果制备的单克隆抗体H7N9-71和H7N9-78均能与H7N9抗原特异性结合,抗体效价达1∶10~5,免疫组化结果表明H7N9-71、H7N9-78与人的胃组织能发生特异性反应,进一步的研究发现这两株单抗与小鼠胃组织能特异性结合。轻重链可变区序列结果证实二者为两株不同的单抗。结论H7N9流感病毒可能与胃组织之间存在异嗜性抗原,提示流感病毒感染可能与胃肠道疾病的发生存在某些关联。

牛支原体NM001株单克隆抗体的制备与鉴定

为获得抗牛支原体NM001株单克隆抗体,并评价其特性,以牛支原体分离株NM001作为抗原免疫6周龄BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术和间接ELISA方法筛选到2株能稳定分泌抗牛支原体的单克隆抗体细胞,命名为2C5和7G3。其细胞上清的间接ELISA抗体效价分别为6.4×10^(3)和1.2×10^(4)。经亚型测定,单抗2C5和7G3均属于IgG1类,轻链均是λ型。制备腹水并对单抗进行纯化和特性鉴定,两株单抗的间接ELISA抗体效价分别为1.02×10^(5)和4.09×10^(5),且两株单抗与无乳支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体、牛巴氏杆菌均无交叉反应。Western Blot结果显示,2株单抗均能特异性识别牛支原体全菌蛋白中的相应蛋白。试验表明,单抗2C5和7G3能够与牛支原体发生特异性反应,从而为牛支原体血清学检测提供一定的物质基础。

抗鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其应用研究

为制备针对鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)的单克隆抗体,以CIAV的VP2原核表达蛋白作为抗原免疫小鼠,经杂交瘤技术获得3株能稳定分泌抗VP2蛋白特异性抗体的细胞株,进一步经IFA筛选出特异性和灵敏度俱佳的杂交瘤细胞Mab-VP2-4株,制备的小鼠腹水效价达到1∶2000。结果显示,制备的抗VP2蛋白单克隆抗体可与多株CIAV感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应,而对EDSV、ALV、ILTV、ARV以及空白MDCC-MSB1细胞、CEF细胞等均无交叉反应,特异性良好,且应用于IFA方法时对CIAV感染的最低检出限为5 TCID 50。以该单克隆抗体对市场上10种不同来源的禽活疫苗进行病毒分离结合单克隆抗体IFA检测,同时与《中国兽药典》规定的鸡检查法进行对比检测,结果一致,均未检出CIAV污染。本研究制备了针对CIAV VP2蛋白的特异性单克隆抗体,为该病特异性诊断方法的建立奠定了基础。

抗白细胞介素-5单克隆抗体治疗哮喘效果的Meta分析

目的:系统评价抗白细胞介素-5(IL-5)单克隆抗体治疗哮喘的临床效果。方法:在PubMed、Embase和Cochrane对照试验中央注册中心检索有关抗IL-5单克隆抗体治疗哮喘的随机对照试验文献,检索时间为截至2024年3月,对数据采用CMA 2.0软件进行Meta分析。结果:纳入21篇文献,共8717例患者,试验组4593例,对照组4124例。Meta分析结果显示,在第1秒用力呼气容积(FEV1)、哮喘生活质量问卷评分、不良事件发生情况方面,试验组优于对照组。结论:抗IL-5单克隆抗体治疗哮喘的临床效果较好,可改善患者FEV1、生活质量,且安全性较高。

基于高通量表面等离子体共振技术筛选与TPBG具有高亲和力的单克隆抗体研究

目的探讨从制备的单克隆抗体中快速筛选出与滋养层糖蛋白(TPBG)具有高亲和力的单克隆抗体的方法。方法采用高通量表面等离子体共振技术(SPR),将不同种属的TPBG通过氨基偶联的方式固定在GLC传感器芯片上,梯度稀释的抗体作为流通相,筛选能高度亲和TPBG的单克隆抗体,并测定相互作用的动力学常数。抗体1结合人和食蟹猴TPBG,亲和力分别为65.0、31.6 nmol/L;抗体6结合人、小鼠、食蟹猴TPBG,亲和力分别为77.6、92.1、87.7 nmol/L。结果该研究成功筛选出2种能与TPBG特异性结合的单克隆抗体。动力学图谱显示,这2种抗体与TPBG蛋白的特异性结合稳定。结论采用SPR可筛选出与TPBG蛋白具有高亲和力的单克隆抗体,为开发出一些新型的抗肿瘤药物提供一种方法。

单克隆抗体与多克隆抗体的混合在胱抑素C测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)中的应用

为优化兔抗人胱抑素C多克隆抗体和人胱抑素C单克隆抗体的混合比例,将不同比例混合的抗体制备成胱抑素C(胶乳免疫比浊法)测定试剂盒,对试剂盒的灵敏度进行测定,从而筛选出最适的混合比例,与进口抗体和市面上较为认可的试剂盒进行应用比较。结果表明,兔抗人胱抑素C多克隆抗体和人胱抑素C单克隆抗体最适的混合比例为70%:30%;将国产兔抗人胱抑素C多克隆抗体、进口胱抑素C多克隆抗体与最适混合比例的抗体相同质量投量料同时包被成试剂,分别命名为试剂1、试剂2、试剂3,三种试剂校准后同时进行临床样本测定及相关性分析、线性实验及抗原过剩测定,数据显示,试剂3与试剂1及试剂3与试剂2之间均具有很强的临床相关性,线性实验和抗原过剩测定数据无明显差异,都可以满足应用要求;将试剂3与市场上口碑较好的的胱抑素C试剂盒进行临床样本测定比对,实验数据显示,两者在临床应用上无明显差异;通过胱抑素C单克隆抗体和多克隆抗体混合,减少了交叉反应的可能性,实现了较好的批间和批内一致性,具备更广泛的识别范围,提供了更全面、准确的识别和检测结果。

卡瑞利珠单克隆抗体联合阿帕替尼治疗中晚期肝细胞癌患者疗效及预后分析

目的探讨应用卡瑞利珠单克隆抗体联合阿帕替尼治疗中晚期肝细胞癌(HCC)患者的疗效及其影响预后的因素。方法2019年6月~2021年10月新疆医科大学第一附属医院收治的中晚期HCC患者117例,其中联合治疗组65例接受卡瑞利珠单克隆抗体联合阿帕替尼治疗,另52例接受阿帕替尼治疗。根据mRECIST评价肿瘤治疗效果,采用Kaplan-Meier法分析无进展生存期(PFS)及其影响因素,应用多因素COX回归分析影响PFS的因素。结果随访12月,联合治疗组客观缓解率(ORR)和疾病控制率(DCR)分别为44.7%和66.2%,显著高于阿帕替尼治疗组的15.4%和42.3%(P<0.05);在治疗3个月末,联合治疗组血小板(PLT)计数为81.0(51.5,145.5)×10^(9)/L,显著低于单药治疗组[107.0(69.5,191.0)×10^(9)/L,P<0.05];联合治疗组PFS为10.6(95%CI:9.986~11.16)个月,显著长于阿帕替尼组的7.9(95%CI:6.84~8.944)个月(Log-rank=12.807,P<0.05);体力活动状态(PS)、Child-Pugh评分、CNLC分期、有无肝硬化、门脉癌栓和肝动脉化疗栓塞术(TACE)是影响PFS的因素(P<0.05);COX多因素回归分析显示,Child-Pugh B级(HR=2.379,P=0.021)和伴有门脉癌栓(HR=3.481,P=0.003)是影响中晚期HCC患者PFS的独立危险因素,而TACE(HR=0.528,P=0.034)则是独立保护因素。结论应用卡瑞利珠单克隆抗体联合阿帕替尼治疗中晚期HCC患者能有效提高疗效,延长生存时间。对于肿瘤负荷较大的患者,加用TACE联合治疗可以帮助临床获益。

乌司奴单克隆抗体治疗克罗恩病的短期临床疗效及影响因素

目的探讨乌司奴单克隆抗体(UST)治疗克罗恩病(CD)的短期临床疗效及影响因素,为UST的临床应用提供更多的证据支持。方法采用回顾性队列研究方法,收集2020年12月至2022年10月在同济大学附属第十人民医院采用UST治疗的CD患者临床资料。主要分析UST治疗CD第8、16周的短期临床疗效和影响因素,并分析部分患者的内镜缓解率。结果共纳入91例初次使用UST的CD患者。UST治疗CD第8/16周的临床应答率分别为61.5%、71.4%,临床缓解率分别为45%、54.9%。单因素分析表明瘘(包括肛瘘、肛瘘个人史、肠皮瘘)与CD第8/16周的临床缓解有关。多因素COX分析提示,有肛瘘手术史相比于无瘘者是影响UST治疗CD第8周(HR=0.04,95%CI:0.00~0.38;P<0.01)和16周(HR=0.04,95%CI:0.01~0.34;P<0.01)临床缓解的独立保护性因素;狭窄型病变相较于非狭窄非穿透性病变,是CD患者16周临床缓解的独立危险因素(HR=1.75,95%CI:1.08~2.84;P<0.05)。56例于我院复查内镜,16周的内镜缓解率为41.1%。未发现有患者因严重不良反应停止用药。结论UST能够改善CD第8/16周的临床缓解与临床应答,具有较好的短期临床疗效。有肛瘘个人史的CD患者推荐应用UST单抗,具有狭窄型病变的患者需谨慎应用UST单抗。患者既往是否行手术治疗,以及UST一线或非一线应用,均对临床缓解无明显影响。

猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立

旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化后建立了一种检测PCV3抗体的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测50份临床阴性血清,计算阻断率(PI)的临界值,以此来确定该方法的判定标准:当PI≤28.30%时,判定结果为阴性;当PI≥35.05%时,判定结果为阳性;当28.30%<PI<35.05%时,判定为可疑,重复一次试验后如果结果仍为可疑,则判定为阳性。特异性试验表明该方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪瘟病毒(CSFV)的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验表明其检测效价可达到1:128;重复性试验表明批内与批间的变异系数均小于10%;符合性检验表明该方法与PCV检测金标准免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)比对的Kappa值达0.9,具有高度的一致性。综上所述,本研究建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性与较高的符合率,可用于后期进行PCV3抗体的检测,为PCV3的流行病学调查与临床诊断提供技术支持。

基于马立克病病毒Meq蛋白单克隆抗体的免疫组化诊断方法的建立

为了对临床上马立克病(MD)准确诊断,研究利用杆状病毒表达系统表达马立克病病毒(MDV)强毒株Meq重组蛋白免疫小鼠,利用杂交瘤技术研制MDV Meq蛋白特异性单克隆抗体,并以此为基础建立MD诊断方法。结果显示:试验成功制备了4株Meq蛋白特异性单克隆抗体,分别命名为MDV-Meq-1D6、MDV-Meq-1D10、MDV-Meq-6B3、MDV-Meq-6D10;Western blot结果证明这些单克隆抗体不仅能与体外表达的Meq蛋白反应,而且能识别MD肿瘤细胞系MSB-1中的Meq蛋白和MD肿瘤组织细胞中的Meq蛋白;以Meq蛋白单克隆抗体成功建立免疫组化诊断MD的方法,该方法特异性强,结果稳定,易观察判定。研究表明,试验制备了4株Meq蛋白单克隆抗体(MDV-Meq-1D6、MDV-Meq-1D10、MDV-Meq-6B3、MDV-Meq-6D10),基于此建立的免疫组化MD诊断方法为临床MD鉴别诊断提供技术支撑。

布鲁氏菌LPS单克隆抗体的制备与鉴定

制备布鲁氏菌LPS特异性单克隆抗体,为建立布鲁氏菌病血清学及新型免疫传感器检测方法提供有效试剂。将天然提取的布鲁氏菌LPS抗原使用长程免疫法腹腔注射BALB/c小鼠,经过5次常规免疫及1次加强免疫后,取小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,使用间接酶联免疫吸附试验(iELISA)对杂交瘤细胞进行筛选,并对纯化后的单克隆抗体进行生物特性鉴定。结果表明:筛选出3株稳定分泌单抗的阳性细胞株,分别命名为2-4A、3-4E、5-10B;经过亚型鉴定,3-8E、2-4A为IgG1亚型,5-10B为IgG2b亚型。将5-10B细胞株使用腹腔注射法制备腹水,并通过Protein A柱纯化腹水。纯化后单抗达到了电泳纯,BCA法测定其浓度最高可达1.431 8 mg·mL^(-1), ELISA效价达到1∶512 000,间接ELISA结果显示制备的抗体具有良好的特异性。研究制备的高特异性、高活性的单克隆抗体可为后续布鲁氏菌病特异性诊断技术研究提供参考。

基因Ⅳ型禽呼肠孤病毒σC蛋白单克隆抗体的制备及功能鉴定

为制备基因Ⅳ型(GCⅣ)禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)σC蛋白单克隆抗体,构建了重组原核表达质粒pCold-I-ARV-GCⅣ-σC,将重组质粒导入感受态细胞BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达;随后将纯化后的σC蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术制备杂交瘤细胞,利用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选获得阳性杂交瘤细胞;以间接免疫荧光(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)试验鉴定杂交瘤细胞后,将杂交瘤细胞株通过腹腔注射小鼠制备单克隆抗体腹水,以ELISA测定腹水效价。结果显示:成功筛选出一株分泌ARV GCⅣσC蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株(1H4);制备的单克隆抗体能与ARV GCⅣσC蛋白发生反应,同时与感染不同基因型ARV的鸡肝癌细胞(LMH)均有良好的反应性;该单克隆抗体识别重链为IgG1,其腹水ELISA效价为1:256000。结果表明,成功制备ARV GCⅣσC蛋白单克隆抗体,其效价高,反应性良好,为进一步研究σC蛋白功能、ARV致病机理以及建立临床诊断方法奠定了基础。

抗传染性法氏囊病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectious bursal bursal virus,IBDV)引起的一种高度传染性疾病,以雏鸡法氏囊萎缩、腿肌出血等为特征性病变,给世界家禽产业造成重大经济损失。目前,由新型变异株引起的IBD在我国呈现流行趋势。为建立基于IBDV VP2蛋白的免疫学诊断技术,本研究以新型变异毒株IBDV-LY21/2为模板,扩增其VP2基因,随后构建重组原核表达质粒pCold-Ⅰ-IBDV-VP2并转化BL21(DE3)大肠杆菌进行诱导表达,通过考马斯亮蓝染色和Western blot检测重组蛋白His-VP2的表达情况,并对其进行纯化和浓度测定。将His-VP2免疫BALB/c小鼠后,采用iELISA检测血清抗体效价,最后制备单克隆抗体并对其鉴定。结果显示,获得的重组蛋白His-VP2分子量约为50 kDa,浓度为8 mg/mL;通过两次亚克隆获得3株杂交瘤细胞株1G10F12、3E3E9、4D12G12,且重链均为IgG1型,轻链均为κ型;其中1G10F12、3E3E9可与重组蛋白Myc-VP2产生Western blot和IFA反应,而4D12G12只能与其产生IFA反应。本研究为IBD诊断方法的建立奠定了基础,同时为深入研究VP2蛋白的功能提供生物学工具。

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

【目的】获得可溶性非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)p54蛋白和抗p54蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibodies, mAb),并分析其识别的线性抗原表位,为p54蛋白结构和功能的研究及血清学诊断试剂的研发奠定基础。【方法】构建了重组原核表达质粒pET-21a-E183L,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,表达并利用Ni2+柱和分子筛纯化得到p54重组蛋白。以该蛋白为抗原免疫5周龄SPF级BALB/c小鼠,每两周免疫一次,共免疫3次,首免时将p54蛋白与弗氏完全佐剂混匀乳化(150μg/只),二免、三免使用弗氏不完全佐剂。三免7 d后对小鼠进行尾部采血,使用ELISA方法测定小鼠血清抗体效价,选取效价高的小鼠进行加强免疫。3 d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合,利用重组p54蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的mAb细胞株,并制备腹水。以pCAGGS-Flag-E183L质粒转染的HEK293T细胞和ASFV Pig/HLJ/18株感染的猪肺泡巨噬细胞(PAMs)为抗原,以筛选得到的mAb为一抗,进行Western blot鉴定和间接免疫荧光试验(IFA)。使用单抗亚类鉴定试剂盒检测该mAb重链和轻链类型。随后,将p54蛋白逐步截短并与GST标签融合表达后进行Western blot检测,鉴定该mAb识别的抗原表位。【结果】将构建的原核表达质粒pET-21a-E183L(54-183aa)转化至BL21(DE3)感受态细胞中,使用IPTG进行诱导后,p54重组蛋白大部分以可溶的形式在上清中表达,分子量约为17 kDa。以纯化得到p54重组蛋白免疫小鼠,三免后7 d的血清效价为1:409 600,可进行细胞融合,经四次筛选和亚克隆后,获得能够稳定分泌p54蛋白mAb的细胞株,命名为5B11,成功制备腹水并纯化。Western blot和IFA试验结果显示,制备的mAb能够特异性识别HEK293T细胞中表达及ASFV感染PAMs中的p54蛋白。mAb亚类鉴定结果显示重链类型为IgG1型,轻链类型为κ链。该mAb识别的抗原表位序列为^(80)VTPQPGTSKPA^(90)。【结论】利用原核表达体系可溶性表达了ASFV p54蛋白的第54-183位氨基酸,并以纯化的蛋白为抗原制备了抗p54蛋白的mAb,并对其识别的抗原表位进行鉴定,丰富了p54蛋白的抗原表位信息,为ASFV血清学检测提供了基本材料。

抗鸡早幼粒细胞白血病蛋白单克隆抗体的制备及其在荧光检测中的应用

【目的】探究鸡早幼粒细胞白血病蛋白核小体(PML NBs)在马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染过程中的生物学功能,制备抗鸡早幼粒细胞白血病蛋白(Ch-PML)单克隆抗体,建立可视化检测Ch-PML的方法。【方法】通过原核表达系统制备Ch-PML重组蛋白,并将其作为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术将骨髓瘤细胞和免疫小鼠的脾细胞进行融合,用ELISA方法筛选出分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,通过体内诱生法制备腹水并用Protein A/G纯化抗Ch-PML单克隆抗体,利用Western blotting和ELISA方法检测单克隆抗体的特异性、亲和力和亚类,最后利用该单克隆抗体建立用于鸡PML NBs的间接免疫荧光试验(IFA)检测方法。【结果】Ch-PML蛋白在大肠杆菌中可溶性表达,分子质量大小为19 ku;以此蛋白成功制备了1株抗Ch-PML单克隆抗体,该抗体具有良好的特异性和高亲和力,经亚类和型检测,其为IgG2b亚类,轻链为Kappa型。利用制备的抗Ch-PML单克隆抗体建立的IFA检测方法发现,内源性PML NBs在宿主细胞核中呈点状分布,过表达的Ch-PML在宿主细胞核中形成团块状聚集体,且MDV感染宿主细胞后核内PML NBs数量比未感染细胞显著减少(P<0.05),说明MDV感染导致核内的PML NBs组装受到抑制。【结论】本研究利用制备的抗Ch-PML单克隆抗体建立了鸡PML NBs的IFA检测方法,并发现MDV抑制宿主细胞PML NBs组装这一现象,为MDV致病机制的解析提供了新的研究思路和工具。