玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及胶体金免疫层析法的建立

目的制备并鉴定玉米赤霉烯酮(ZEN)单克隆抗体(mAb),并初步建立ZEN的胶体金免疫层析检测方法。方法采用活泼酯法制备人工抗原ZEN-OVA和ZEN-BSA,以ZEN-OVA作为免疫原制备ZEN mAb。ELISA法鉴定抗体效价、亚类、特异性等。ZEN mAb-胶体金复合物包被于胶体金结合垫上,检测原ZEN-BSA和山羊抗小鼠IgG分别结合于硝酸纤维膜上作为检测线(T线)和质控线(C线),建立ZEN的胶体金免疫层析检测法。结果经紫外分光光度法和SDS-PAGE鉴定,ZEN人工抗原合成成功。经3次克隆化后,筛选出1株能稳定分泌ZEN mAb的杂交瘤细胞株1G4,腹水效价为1∶1.6×105;抗体亚类为IgG2b;对ZEN的IC50为10.2 ng/mL,检测限为0.58 ng/mL。mAb对ZEN具有高度的特异性,除与β-玉米赤霉烯醇的交叉反应率为12.8%外,与其他ZEN代谢物α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮及其他相似毒素呕吐毒素、伏马毒素、赭曲霉素A等几乎无交叉反应。制备的胶体金免疫层析试纸条在5 min内即可肉眼观察到结果,对ZEN的最低检测限为100 ng/mL。结论成功制备出1株ZEN mAb,并初步建立了其胶体金免疫层析检测方法,最低检测限为100 ng/mL。

抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的研制与胶体金免疫层析方法的建立

目的制备抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)的单克隆抗体(McAb),将其标记胶体金,建立一种诊断恶性疟的胶体金免疫层析方法.方法用基因重组的GDH蛋白免疫Balb/C小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备McAb,测定其免疫球蛋白亚类及其亲和力.用protein-G亲和层析纯化抗体并用胶体金标记,建立胶体金免疫层析方法,选择最佳反应模式对疟疾血样进行检测.结果筛选出6株能稳定分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株,单抗亚类均为IgG1,亲和常数(κ)介于1×10-8～2.82×10-10.以镜检法为参照,建立的胶体金免疫层析方法检测恶性疟的敏感性为86.66%,特异性为96.43%.结论建立的胶体金免疫层析方法检测恶性疟快速、简便、可靠,有望开发成为恶性疟快速诊断试剂盒.

胶体金-酶联雌二醇法、酶联雌二醇法和单克隆抗体免疫组化法的比较

目的 :进一步验证作者自行设计的胶体金 -辣根过氧化物酶 -雌二醇 (CG- HRP- E2 )标记组织内雌激素受体技术的可靠性和准确性。方法 :采用 CG- HRP- E2 与酶联雌二醇 (E2 - HRP)法、单克隆抗体免疫组化法 ,通过电子显微镜在细胞超微结构水平上研究了子宫内膜组织内的雌激素受体。结果 :3种方法标记的雌激素受体主要分布在细胞核内 ,少部分分布在胞质中 ,其结果完全是一致的。

酶联免疫法与胶体金法检测HIV抗体的效果对比

目的:比较酶联免疫法与胶体金法检测人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体的效果。方法:选择聊城市疾病预防控制中心2021年1月—2022年12月收集的110例疑似艾滋病(AIDS)患者的血液样本,全部样本均采用蛋白印迹法、酶联免疫法、胶体金法检测,以蛋白印迹法检测结果为金标准,对比分析酶联免疫法、胶体金法检测HIV抗体的灵敏性、特异性、准确性。结果:110份血液样本中,蛋白印迹法检出HIV阳性、阴性分别有65份、45份;酶联免疫法检出HIV阳性、阴性分别有70份、40份;胶体金法检出HIV阳性、阴性分别有78份、32份。酶联免疫法、胶体金法检测HIV抗体的特异性分别为88.89%、71.11%,准确性分别为95.45%、88.18%;酶联免疫法检测HIV抗体的特异性、准确性均高于胶体金法,差异有统计学意义(P<0.05);但两种检测方法的灵敏性(100.00%vs100.00%)对比,差异无统计学意义(P>0.05)结论:在HIV抗体检测方面,胶体金法和酶联免疫法的准确性均较高,但酶联免疫法的特异性、准确性更高,可获得更准确的检测结果,利于AIDS的早期诊断。

猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备及胶体金免疫层析检测方法的建立

为了建立快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究用PEDV免疫BALB/c小鼠,制备杂交瘤细胞。分别采用间接ELISA和表面荧光吸附法(CSFIA)筛选,共得到33株能够稳定分泌抗PEDV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株。通过制备小鼠腹水并纯化后测得其中21株细胞分泌的MAb的ELISA效价在1∶1.6×104以上,且均仅与PEDV反应,不与TGEV和PRV反应,特异性较强。采用双抗体夹心ELISA法筛选出能够配对检测PEDV的MAb有5株,以其中的4H7为检测抗体、5A9为俘获抗体初步建立了检测PEDV的GICA。该GICA特异性试验结果显示,除了PEDV检测结果为阳性外,该方法对伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和传染性胃肠炎病毒的检测结果均为阴性,特异性较强;该方法针对PEDV的最低检测限为7.8×103TCID50/mL,敏感性较高;批内和批间重复性检测样品结果无明显差异,具有较好的重复性;将该方法和RT-PCR方法同时检测115份临床样品,该方法与RT-PCR阳性符合率为93%。本实验制备的PEDV MAb,以及基于该AMbs初步建立的检测PEDV的GICA为开发快速检测PEDV的胶体金免疫层析试纸条奠定了基础。

酶联免疫法与胶体金层析法对HIV抗体检测结果的比较

目的评估酶联免疫法与胶体金层析法对HIV抗体的检测性能。方法2021—2022年对3423份血液样本同时用酶联免疫法和胶体金层析法检测,以免疫印迹法为金标准确证结果。结果酶联免疫法检出有反应样本5份,胶体金层析法检出有反应样本9份,经免疫印迹实验确证阳性4份。酶联免疫法假阳性1份,假阳性率0.03%;胶体金层析法假阳性5份,假阳性率0.15%,2种方法差异无统计学意义(χ^(2)=2.64,P=0.26)。2种方法检测HIV抗体的灵敏度均为100%,酶联免疫法的特异度(99.97%)略高于胶体金层析法(99.85%),Kappa值均≥0.6,检测一致性较好。结论酶联免疫法和胶体金层析法均可用于HIV抗体检测,酶联免疫法的假阳性率更低,胶体金层析法操作更为简便,可结合实际需要选择合适的方式进行HIV筛查。

基于单克隆抗体的胶体金免疫层析法快速检测丙溴磷

为实现蔬菜中丙溴磷的现场快速检测,采用免疫层析技术对丙溴磷残留的胶体金快速检测试纸条的制备开展研究。用胶体金颗粒标记丙溴磷单克隆抗体作为检测探针,以硝酸纤维素膜为固相载体,包被丙溴磷半抗原-卵清蛋白偶联物为检测线、羊抗鼠IgG为质控线,建立丙溴磷的胶体金快速检测试纸条。结果表明,该试纸条的检出限为0.10 mg/kg、灵敏度96%、特异性93%、假阴性率4%、假阳性率7%、相对准确度94.5%,重复性较好。胶体金试纸条操作简便、检测速度快、成本低,适用于蔬菜中丙溴磷残留的现场筛查和检测。

铬离子单克隆抗体的制备及食品总铬含量检测胶体金免疫层析试纸条的研制

目的:制备三价铬离子螯合物单克隆抗体(Cr^(3+)-EDTA m Ab),研制胶体金免疫层析试纸条(Cr-Strip)。方法:用异硫氰酯法合成Cr^(3+)-i EDTA-BSA,UV和ICP-AES进行鉴定;细胞融合技术筛选Cr^(3+)-EDTA m Ab细胞株,体内诱生腹水法制备Cr^(3+)-EDTA m Ab,并对其特性进行分析;应用Cr^(3+)-EDTA m Ab研制Cr-Strip,并测定其性能。结果:筛选出3株杂交瘤,最好的是2A11G5,Ka为2.69×109L/mol,对Cr^(3+)-EDTA的IC50为9.84μg/L,与其他重金属离子无交叉反应;Cr-Strip的检测时间为10 min,检测限为5μg/L,其检测结果与ICP-AES符合率为100%。结论:制备出了高质量的Cr^(3+)-EDTA m Ab,研制出更为灵敏的Cr-Strip。

应用抗SjP38的单克隆抗体建立血吸虫感染的胶体金免疫层析检测体系

目的建立一种检测日本血吸虫感染的胶体金免疫层析方法。方法将已获得的单抗用protein-G亲和层析纯化,通过间接ELISA测定每株单抗的亲和常数。按改良过碘酸钠标记法,8株单抗标记辣根过氧化物酶(HRP)后进行不同株单抗配对,选出亲和力高、稳定性强的单抗配对组合。胶体金标记4株抗体,选择最佳反应模式,建立胶体金免疫层析方法,并对弓形虫感染鼠血样、血吸虫感染前和感染后2、3、4、5、6周的鼠血样进行检测。结果8株抗SjP38单克隆抗体经纯化后纯度达95%以上,其亲和常数介于1×10-8mol/L^2.82×10-10mol/L。根据配对实验,1A6与9H6、1A6与9G7、6G12与9H6、6G12与9G7以及9H6与9G7为最佳配对组合。标记1A6、6G12、9H6与9G7这4株单抗后筛选出最佳反应模式,即以9G7为包被抗体,包被浓度为2.5μg/μl;当1A6为金标抗体,抗体稀释浓度为1:4时,检测效果最佳。对rSjP38的最低检测量为12.5ng/ml。抗检测感染3、4、5、6周小鼠血清,阳性率分别为40%、50%、60%、80%,而弓形虫感染鼠和血吸虫感染前小鼠血样的检测结果为100%阴性。结论通过抗体配对、最佳包被量和金标抗体稀释倍数条件的优化,建立了快速、简便、特异的胶体金免疫层析方法,自制的rSjP38试纸条能检测血吸虫早期感染鼠血清中的循环抗原SjP38。

出血性大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体制备及免疫胶体金试纸条的研制

将骨髓瘤细胞SP2/0与出血性大肠杆菌O157∶H7免疫小鼠得到的脾细胞融合,通过筛选得到3株稳定分泌抗出血性大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株D3、E7、B9,D3和B9亚类为IgG1,E7亚类为IgG2a,轻链亚型均为κ。交叉反应结果显示这3株单抗仅结合出血性大肠杆菌O157∶H7,对15株其他细菌无反应,测得胶体金标记单抗最佳pH、最佳结合量分别为D3:pH 7.5~8.0、24μg/mL;B9:pH 7.5、12μg/mL;E7∶pH7.5、18μg/mL,抗体配对选择胶体金结合D3喷涂金标垫、E7以1 mg/mL喷涂NC膜作T线为最优组合,试纸条检测出血性大肠杆菌O157∶H7灵敏度为2.1×106CFU/mL,且仅可检出出血性大肠杆菌O157∶H7,对25株其他细菌均无交叉反应,模拟带菌实验表明,对市售面包、牛奶、果冻各25 g(mL)均添加约200 CFU出血性大肠杆菌O157∶H7,增菌培养8、10、10 h即可检出。研究表明,实验自主制备的抗体性能良好,试纸条特异性、灵敏度达到国外同类产品,可在政府食源性致病菌监管部门、食品企业推广运用。

雌二醇单克隆抗体制备及胶体金侧流层析免疫分析方法的建立

目的探讨雌二醇(17β-estradiol,E2)的3号位和17号位引入活性基团制备的半抗原对抗体灵敏度的影响,选用灵敏度较高的抗体建立一种牛奶中E2胶体金侧流层析免疫分析方法(colloidalgold-basedlateral flow immunoassay,CG-LFA)。方法从E2的3号位羟基和17号位羟基引入活性基团分别制备半抗原H1a和H2,偶联载体蛋白制备完全抗原,经过动物免疫和细胞融合筛选,制备单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAbs),采用间接竞争酶联免疫吸附实验(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,icELISA)对mAbs性能进行评估,筛选出灵敏度最高的mAb,最后采用静电吸附法将胶体金标记抗体为探针,构建牛奶中E2的CG-LFA。结果制备了H1a-7B7、H1a-7B12、H1a-9C7、H1a-10E7、H2-2E2、H2-3C10、H2-4A10和H2-6D28种mAbs,经过icELISA评估,其半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)分别为0.116、0.207、0.072、0.370、0.442、6.170、0.415和4.411 ng/mL,最终选取H1a-9C7,构建牛奶中E2的LFA,消线(cut-off)值为6.00ng/mL,与苯甲酸雌二醇和雌三醇的交叉反应率分别为101.31%和2.43%,在真实样本加标回收实验中,检测结果与液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)结果一致。结论E2的3号位引入活性基团设计合成的半抗原所制备的E2抗体灵敏度,比17号位引入活性基团制备的抗体灵敏度高,并且建立的LFA准确度良好,为牛奶中E2快速检测提供了一定的技术手段。

大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制

用E.coliO157∶H7菌体免疫BALB/c鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得了16株分泌单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞株。其中,1D3、2E7和2H7三株为O157∶H7特异单克隆抗体,Ig亚类分别为IgMκ、IgG2bκ和IgG2bκ,腹水抗体ELISA效价分别为103、105和106。用纯化的单克隆抗体2E7标记胶体金,制备金标抗体玻璃纤维素膜;将纯化的2H7和羊抗鼠IgG分别作为检测和对照捕捉抗体包被于硝酸纤维素膜（NC）上;组装成双抗夹心法O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条。用该试纸条可特异检测O157∶H7,敏感度为106CFU/mL,与相同单克隆抗体2H7和2E7建立的O157∶H7夹心ELISA检测方法的敏感度相当,试纸条简便快速,在1~5 min内可得出检测结果,便于O157∶H7的临床快速诊断与现场检测样品的快速筛查。

呋喃它酮代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮单克隆抗体的制备、鉴定与胶体金免疫层析试纸条的研制

目的:制备5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)单克隆抗体,并建立AMOZ胶体金试纸条检测方法。方法:AMOZ与对醛基苯甲酸反应生成半抗原CP-AMOZ,将CP-AMOZ与BSA、OVA偶联制备完全抗原。免疫小鼠后制备腹水型抗体,ELISA检测抗体效价与其对CP-AMOZ半抑制浓度(IC50)和最低检测限(LOD),并检测抗体的特异性。胶体金与单抗偶联,同时在NC膜上包被完全抗原、兔抗鼠多抗分别作为检测线和质控线,制备免疫层析试纸条,测定试纸条的灵敏度与特异性。结果:成功制备CP-AMOZ-BSA、CP-AMOZ-OVA完全抗原及抗CP-AMOZ的单抗,抗体效价为1∶1.6×105,对CP-AMOZ IC50为0.86μg/L,LOD0.07μg/L,与其他硝基呋喃类药物代谢物及其衍生物均无交叉反应。制备的胶体金试纸条灵敏度5μg/L。结论:成功合成了CP-AMOZ的完全抗原,免疫小鼠后制备了特异性强的单抗,并以此为基础研制出敏感、特异的胶体金快速检测试纸条。

鳗弧菌单克隆抗体-胶体金检测方法的建立

以灭活鳗弧菌(SMW5)全菌为抗原,应用杂交瘤技术,制备了鳗弧菌单克隆抗体3株,分别命名为1H9、1C12、6F8,细胞亚类分别为IgG2a、IgM、IgG2b,其中1H9腹水效价为1∶6.4×105。制备鳗弧菌(SMW5)兔多克隆抗体,效价为1∶3.2×105。应用纳米胶体金颗粒标记单克隆抗体1H9并制备金标垫,抗鳗弧菌(SMW5)兔多克隆抗体与羊抗鼠抗体作为捕获抗体包被硝酸纤维素膜,分别作为检测线T和质控线C,建立鳗弧菌的胶体金免疫层析快速检测方法。经过对试纸条的特异性和灵敏度测定,结果表明:试纸条与嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、副溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌,7种水产常见病原菌没有交叉反应,与鳗弧菌特异性反应,检测灵敏度为6.3×104cfu·mL^(-1),检测所需时间低于10min。所制备的鳗弧菌胶体金免疫层析检测试纸条具有快速、简便、特异性高和适应基层生产推广应用等优点。

应用B.melitensis 16M单克隆抗体建立羊布病的胶体金免疫层析检测体系

[目的]用B.melitensis16M提纯的LPS和O链抗原作为检测抗原,研制出针对B.melitensis16M的单克隆抗体(McAb),将其标记胶体金,建立一种诊断布病的胶体金免疫层析方法。[方法]B.melitensis16M全菌免疫Balb/C小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备McAb,测定免疫球蛋白亚类及亲和力。用HiTrapProteinGHP亲和层析纯化抗体并用胶体金标记,建立胶体金免疫层析方法。选择最佳反应模式组装成试纸条,对其特异性、敏感性、稳定性、阳性病料试验。[结果]筛选出能稳定分泌抗B.melitensis16M的种特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株2D10、3C6、1E10,单抗亚类分别为IgG2a、IgG1,亲和常数(k)介于1×10-8￣2.6×10-10。根据配对实验,以3C6为最佳包被抗体,2D10为最佳金标抗体。抗体IgG标记浓度为30μg/ml时,检测效果最佳。同时,与B.melitensis16M多抗IgG作为包被抗体、2D10为金标抗体的检测体系对比,两种包被方法组装的试纸条最低检出量为5.0×103CFU/ml,且不与其它菌发生交叉反应,保持期≥100d。以荧光定量PCR为参照,试纸条检测80份阳性病料,检检出率为100%。[结论]建立的胶体金免疫层析方法检测B.melitensis16M快速、简便、可靠,有望开发成为布病快速诊断试剂盒。

胶体金免疫层析法与酶联免疫吸附试验在梅毒螺旋体特异性抗体检测中的应用分析

目的探究梅毒螺旋体特异性抗体检测中胶体金免疫层析法(GICA)与酶联免疫吸附试验(ELISA)的应用价值。方法选取2020年7月至2022年9月我院收治的80例疑似梅毒感染患者,均接受GICA、ELISA、TPPA检查。以TPPA结果为“金标准”,分析GICA、ELISA检查结果;分析GICA、ELISA诊断价值,并计算一致性进行;另对比GICA、ELISA检测满意度。结果相比于ELISA检测,GICA检测诊断灵敏度、准确度及阴性预测值均较高(P<0.05)。一致性检验,GICA诊断一致性尚可(kappa值=0.771,P=0.000),ELISA诊断一致性不佳(kappa值=0.385,P=0.000)。相比于ELISA检测,GICA检测满意度较高(P<0.05)。结论GICA与ELISA均可在梅毒螺旋体特异性抗体中进行检测,但GICA检测应用价值更高,一致性较强,且患者满意度较高,可将其作为首选检测方法。

犬细小病毒单克隆抗体的制备及其在胶体金免疫层析试纸研发中的应用

为制备犬细小病毒胶体金免疫层析试纸,将F81细胞中分离的CPV免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,建立间接ELISA方法筛选分泌CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞,获得1株能稳定分泌CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3E2。3E2的亚类为IgG1型,腹水抗体效价为1.8×105,交叉试验表明,3E2可与CPV特异性结合,与其他犬常见病毒无交叉反应。用3E2单克隆抗体制备的检测CPV的胶体金免疫层析试纸条特异性良好,为诊断和研究CPV奠定了基础。

蓖麻毒素B链蛋白多克隆抗体的制备及胶体金免疫层析快速检测法的建立

目的：结合蓖麻毒素（RT）的多克隆抗体和单克隆抗体,建立检测RT的胶体金免疫层析快速检测方法。方法：将纯化得到的重组蓖麻毒素B链蛋白（rRTB）免疫兔,获得抗血清经正辛酸-硫酸铵分步沉淀法纯化,利用间接ELISA方法鉴定抗体效价和特异性。结合抗重组蓖麻毒素A链蛋白（RTA）单克隆抗体,采用双抗体夹心法,建立检测天然RT的胶体金免疫层析技术,并对该方法进行特异性、敏感性、稳定性等评价;在奶粉、血清、土壤等材料中进行模拟添加RT检测。结果：间接ELISA法测定抗体效价为1：105,并可特异性与rRTB结合;胶体金法能在5～10 min内完成检测,多种不同的蛋白及近缘毒素检测评价显示该法特异性良好,检测灵敏性为50 ng/ml,环境样品的检测敏感性也相同。结论：利用兔抗RTB多抗和抗RTA单抗,建立了适用于现场的快速、特异检测天然蓖麻毒素的胶体金免疫层析方法。

干化学法和胶体金单克隆抗体法在尿液血红蛋白试验中的比较

目的:探讨如何合理利用干化学法和胶体金单克隆抗体法检测尿液血红蛋白。方法:选择200例干化学法检测尿隐血阴性而尿沉渣分析仪检测红细胞超出参考范围的患者标本离心镜检红细胞,同时采用胶体金单克隆抗体法检测尿隐血;另外选择200例干化学法检测尿隐血阳性而尿沉渣分析仪检测红细胞在参考范围内的患者标本离心镜检红细胞,同时采用胶体金单克隆抗体法检测尿隐血。结果:干化学法检测尿血红蛋白可致假阳性或假阴性,胶体金单克隆抗体法没有干扰物质,特异性强,结果准确。结论:尿液干化学分析仪检测尿隐血在日常工作中起普及和过筛作用,当测定结果可疑时,应采用胶体金单克隆抗体法检测予以校正。

胶体金法及酶联免疫法应用于艾滋病抗体检测的价值分析

目的分析在艾滋病病毒抗体检测中,应用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)和胶体金法的检验效果。方法选取2018年6月—2023年6月海安市疾病预防控制中心复检人类免疫缺陷病毒抗体检测的90份样本作为研究对象,均应用胶体金法及ELISA法检测。比较两种检测方式的诊断效能。结果胶体金法检测灵敏度93.33%、特异度86.67%、准确度92.22%;ELISA法检测灵敏度100.00%、特异度93.33%、准确率98.89%。ELISA法检测灵敏度及准确度均优于胶体金法,差异有统计学意义(χ^(2)=5.172、4.709,P均<0.05)。结论在艾滋病诊断中,应用ELISA及胶体金法均有较高的诊断效能,ELISA法检测灵敏度及准确度均优于胶体金法。