淋球菌单克隆抗体免疫荧光法检测淋病的初步临床应用研究

我们应用单克隆技术制备了抗淋球菌的特异抗体,采用免疫荧光法对120例急、慢性淋病进行了检测,本法具有特异性强、快速、操作简便之优点,易推广。有临床应用价值。方法和结果一、特异性淋球菌抗体的制备应用淋巴细胞杂交瘤技术,按常法制备。单克隆抗体腹水按下述两法保存:(1)

单克隆抗体免疫荧光法检测解脲支原体

非淋菌性尿道炎(NGU)是指由淋球菌以外病原体引起的尿道炎.解脲支原体(UU)是NGU最常见的病原体之一[1].UU的实验室检测方法有培养法、细胞学检查、直接荧光抗体检查、酶免疫法、分子生物学方法、血清学检查等.快速、简便、价廉、特异性好是临床检验的基本要求,自2000年6月～12月对100例泌尿、生殖道感染患者,应用单克隆抗体免疫荧光法检测UU,同时做UU培养对照.现报告如下.

弓形虫GRA1蛋白单克隆抗体的制备与间接免疫荧光检测方法的建立

本研究旨在利用原核表达系统表达弓形虫GRA1蛋白并制备单克隆抗体,用于弓形虫病的诊断及GRA1蛋白功能研究。以弓形虫cDNA为模板,设计引物扩增GRA1基因片段,构建原核表达质粒,转化至BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达蛋白并纯化。用纯化后的重组蛋白作为免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体并鉴定。以制备的弓形虫GRA1单克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗,优化反应条件建立弓形虫间接免疫荧光检测方法。结果表明:成功构建了原核表达质粒pET-30a(+)-TG-GRA1;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白GRA1为可溶性表达,分子量约为27 kDa;Western blot结果显示重组蛋白GRA1可被犬弓形虫阳性血清识别,表明GRA1有良好的反应原性。成功筛选出5株单克隆细胞株,分别命名为1-B10、2-C3、2-C9、3-C11以及6-E6,并对它们进行亚型鉴定,其中2-C3、2-C9、3-C11为IgG1,1-B10、6-E6为IgM;IFA结果显示单克隆抗体具有良好的反应原性;建立了mAb 2-C9最佳稀释浓度为0.875μg/mL、最佳孵育时间为1.5 h,FITC标记的羊抗鼠IgG最佳稀释倍数为1∶400、最佳孵育时间为1.5 h的间接免疫荧光检测方法,并对15只小鼠的肝脏组织切片进行检测,结果表明该方法可用于弓形虫动物组织切片的检测,有助于弓形虫感染的实验室诊断及弓形虫的动态分布研究。

单克隆抗体免疫荧光法快速检测粪便中痢疾杆菌的实验研究

首次使用抗福氏痢疾杆菌单克隆抗体作为诊断试剂，标记鼻硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ），对粪便中福氏痢疾杆菌进行快速检测研究。此法可直接用于粪便检测，全过程仅需４０～５０分钟，标本中细菌的存活状态对本法无影响。通过对临床疑似细菌性痢疾的患者粪便标本２１０价的检测，用常规培养法检测阳性者，此法检测均阳性，其一致性为８２．４０％，常规培养法阳性率为４３．３３％，此法检测阳性率为６０．９５％，统计学处理差异非常显著（Ｐ＜０．００１）。

单克隆抗体池免疫荧光法快速检测感染灶中脆弱类杆菌的初步研究

目的 对感染灶中的脆弱类杆菌进行快速检测。方法 首次使用抗脆弱类杆菌单克隆抗体池作为诊断试剂 ,采用免疫荧光法直接检测感染灶中的脆弱类杆菌。结果 对临床 82份感染标本的检测 ,用厌氧培养法检测阳性者 ,此法检测均为阳性 ,其一致性 85 .7%。厌氧培养法阳性率为 48.7% ,此法阳性率为5 7.3 % ,统计学处理二者差异显著 (P <0 .0 5 )。结论 此法特异性强 ,敏感性高 ,快速简便 ,避免了因细菌表面抗原变异而致单一单克隆抗体效价降低甚至“失效”的问题。

间接免疫荧光法筛选抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体及其性质的初步鉴定

目的利用活体骨髓瘤细胞与杂交瘤技术,采用间接免疫荧光分析法(IFA)筛选出更多可识别人呼吸道合胞病毒(RSV)的单克隆抗体,并对其体外性质进行鉴定,以期为RSV的被动免疫治疗以及临床诊断奠定基础。方法以RSV通过滴鼻途径免疫小鼠,同时采用实体瘤技术体内制备骨髓瘤细胞。取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合,利用IFA方法筛选经有限稀释法亚克隆获得的可稳定分泌抗RSV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。通过间接ELISA和Western blot等方法初步分析McAb对RSV蛋白的特异性结合能力,通过免疫酶法(IE)蚀斑减少中和实验和融合抑制实验分析McAb体外保护作用。结果获得4株稳定分泌抗RSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为2A7、3E10、1F10及3G4,经间接ELISA以及Westernblot初步鉴定,获得的4株单克隆抗体可特异性识别RSV蛋白,McAbs 2A7和3E10可分别识别融合糖蛋白(F)蛋白二聚体和单体,McAbs 1F10和3G4可识别黏附糖蛋白(G)蛋白。其中McAbs 2A7与1F10可以在体外抑制RSV对HEp-2细胞的感染,具有中和活性,同时具有融合抑制活性。结论利用IFA法成功筛选了能特异性识别RSV的4种单克隆抗体,初步鉴定显示两种单抗可分别识别F蛋白二聚体和单体,另两种单抗可识别G蛋白。IE法蚀斑减少实验显示两种单抗在体外具有中和活性和融合抑制活性,表明获得的单抗对RSV感染具有一定的预防作用。

采用CD系统单克隆抗体的间接免疫荧光法检测Graves病

1979年龚忠恕（P.CKung）和Goldstein等首次报告抗人T细胞单克隆抗体（McAb）CD系列制备成功。CD3与约70％正常人外周血单个核细胞（PBM）反应,识别全部T细胞;CD4与40—50％正常人PBM反应。

抗鹅细小病毒单克隆抗体的制备及其免疫荧光检测方法的建立

为建立免疫荧光检测鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)的方法,本研究利用超速离心纯化的GPV作为免疫原,制备了3株抗GPV特异性单克隆抗体,依次命名为GPV-Mab-6C8、GPV-Mab-1B9、GPV-Mab-2H8。试验结果表明,3株抗GPV抗体特异性良好,并能够中和GPV对鹅胚成纤维细胞的感染能力。利用抗GPV单抗作为一抗,FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗,建立了检测GPV的间接免疫荧光方法(indirect immunofluorescence assay,IFA),该方法不仅能够检测鹅胚成纤维细胞中的GPV,还能够检测发病鹅组织冰冻切片中的GPV。本研究制备的抗GPV特异性单克隆抗体和建立的检测GPV的免疫荧光方法,为今后GPV细胞活疫苗的检测评价和临床诊断提供了技术手段。

精子处理方法对免疫荧光检测抗精子单克隆抗体的影响

本文比较了用活精子、精子涂片不加固定及不同固定方法对间接免疫荧光检测效果的影响和精子抗原性保存问题。应用免疫荧光法筛选分泌抗精子单克隆抗体杂交瘤细胞系,各种精子处理方法均可采用。但用活精子常因操作中精子丢失而失败;检测与精子尾部结合的单克隆抗体,最好不加固定;检测与精子头部结合的单克隆抗体,用丙酮或4℃乙醇固定为佳;涂片不加固定抗原性易改变,而固定后其抗原性可保持6个月以上。

单克隆抗体免疫荧光法快速诊断合胞病毒肺炎的临床意义(附32例分析)

我科于1987年11～1988年2月月对住院77例支气管肺炎患儿应用我校微生物教研室制备抗呼吸道合胞病毒(RSV)单克隆抗体(McAb)检查患儿咽部脱落细胞中的RSV特异抗原。国外用McAb检查患者咽部脱落细胞中病毒抗原已有报道[1]。

PEDV N蛋白单克隆抗体的制备及间接免疫荧光检测方法的建立

【目的】制备猪流行性腹泻病毒(PEDV) N蛋白单克隆抗体,并建立检测PEDV的间接免疫荧光试验方法。【方法】以重组表达的PEDV N蛋白为免疫原,免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,分离高抗体效价小鼠的脾细胞,与SP2/0细胞融合。筛选分泌抗PEDV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。在已经感染PEDV的Vero细胞中,以抗PEDV N蛋白的单克隆抗体为一抗,FITC-羊抗鼠IgG为二抗,建立PEDV的间接免疫荧光检测方法。【结果】制备的杂交瘤细胞株可以稳定分泌抗PEDV N蛋白抗体,细胞上清液的ELISA抗体效价在1∶3 200以上,而诱导的小鼠腹水抗体效价在1∶1 000 000以上。将单克隆抗体应用在间接免疫荧光试验时,最适条件为-20℃80%(φ)丙酮溶液中固定30 min;一抗用PBS缓冲液按体积比1∶1 000稀释,4℃条件下过夜孵育;二抗用PBS缓冲液按体积比1∶100稀释,37℃条件下孵育1 h。以建立的间接免疫荧光试验方法检测细胞中的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PPRV)、猪肠道α冠状病毒(PEAV)、猪轮状病毒(PoRV)和PEDV,只有PEDV显示阳性,其他病毒均为阴性。【结论】制备了抗PEDV N蛋白单克隆抗体,以该抗体为一抗建立检测PEDV的间接免疫荧光试验方法具有良好的特异性,为PEDV的实验室检测及PEDV在培养细胞中的定位和动态分布提供了有效的手段。

六种抗大鼠Nogo-A分子单克隆抗体的免疫荧光组织化学染色特性的比较

目的:检测和比较6种针对大鼠Nogo-A分子不同表位的单克隆抗体(mAb)应用于中枢神经组织的免疫组化染色特性,从而决定它们今后可能的应用范围和方法。其中4种mAb是针对Nogo-A分子中Nogo66片段,分别命名为No-go66-1、Nogo66-2、Nogo66-3和Nogo66-4;其他2种mAb是针对Nogo-A分子氨基端(570-691)肽段,分别为Nogo-N1和Nogo-N2。方法:利用免疫荧光组织化学,检测Nogo-A mAb抗体对大鼠神经组织的反应性与特异性。结果:正常SD大鼠脊髓组织的免疫荧光组织化学双标结果显示,制备的6种抗大鼠Nogo-A分子mAb均可以与商品化的兔抗大鼠Nogo-A多克隆抗体(PcAb)双标记;其中Nogo66-1、Nogo66-2、No-go66-4和NogoN-2 mAb可与MBP阳性细胞双标记,与GFAP阳性细胞不共存;而Nogo66-3和NogoN-1 mAb不仅可以与MBP阳性细胞双标,同时也可以和GFAP阳性细胞共存。结论:Nogo66-1、Nogo66-2、Nogo66-4和NogoN-2 mAb可很好的识别组织中的Nogo-A分子,用于免疫组化研究。

单克隆抗体间接免疫荧光(IFA)检测猪附红细胞体

为建立利用单克隆抗体检测猪附红细胞体病的间接免疫荧光(IFA)方法,用抗猪附红细胞体的单克隆抗体,对48份疑似猪附红细胞体感染的病猪猪血进行免疫荧光检测,并与血涂片镜检及PCR检测方法进行比较,结果显示IFA检测的阳性率为68.75%,与PCR检测阳性率为77.08%符合率较高,比血涂片的瑞氏和姬姆萨染色镜检阳性率高出近30个百分点;而用猪肺炎支原体、猪链球菌和猪巴氏杆菌作对照,结果均呈阴性。建立的用抗猪附红细胞体的单克隆抗体检测猪附红细胞体病的IFA特异性强,敏感性高;检测临床样品的结果准确可靠。

D-二聚体单克隆抗体制备及其在免疫荧光快速定量检测中的应用

D-二聚体（D．dimer，D．D）是纤维蛋白单体经活化因子XIII作用后形成的交联纤维蛋白凝块，再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物，医学应用上将它作为一个特异性的纤溶过程标记物，反映纤维蛋白溶解功能。与纤维蛋白破坏有关的疾病，如深静脉血栓形成（DVT）、肺栓塞（PE）和弥漫性血管内凝血（DIC）等，均可导致体内D—D水平升高。近年来D．D的临床应用范围越来越广，除了以上提及的疾病外，在恶性肿瘤、糖尿病、肝脏疾病。

多克隆抗体免疫荧光法检测大鼠卡氏肺孢子虫的研究

采用特异多克隆抗卡氏肺孢子虫囊壁抗体检测大鼠支气管肺泡灌洗液和肺组织中卡氏肺孢子虫，被荧光抗体标记的肺胞子虫呈圆形或卵圆形，直径约3～6μm，为特异的苹果绿荧光色的囊壁。受检标本经PronaseE溶解包裹在肺孢子虫包囊外的糖蛋白等物质，其检出效果优于不用PronaseE方法者，亦优于传统的Grocott和Giemsa染色法。本方法具有高度的敏感性和特异性，与白色念珠菌、新型隐球菌无交叉反应。

抗溴化脱氧尿嘧啶核苷单克隆抗体免疫荧光细胞化学染色过程的最佳条件实验研究

抗溴化脱氧尿嘧啶核苷(BrdUrd)单克隆抗体荧光染色过程涉及到以下一些重要步骤:BrdUrd脉冲标记时间长短,核DNA部分变性处理所用盐酸的浓度与处理时间等。应以BrdUrd阳性细胞与阴性细胞之间平均荧光强度之比值,酸处理过程中细胞凝集的比例,细胞群体G_1峰DNA荧光强度及变异系数作为整个染色过程最佳条件的评价标准。在30分钟BrdUrd标记时间,2.4mol/L盐酸30分钟处理时间及抗BrdUrd单克隆抗体20℃1小时温育时间等条件下,可获得满意的染色结果,并且不需要核糖核酸酶的处理。本实验室将KF-1、KFr、HeLa、IK-90等几种培养细胞系用此方法染色均可获得满意的染色结果。