基于单分子实时测序技术分析平坝窖酒小曲微生物菌群多样性

该研究利用单分子实时测序技术(SMRT)对平坝窖酒小曲中的微生物菌群多样性进行分析。结果表明,平坝窖酒小曲微生物的Chao1指数、Shannon指数、InvSimpson指数值分别为507、4.58、6.06,表明平坝窖酒小曲微生物的菌落组成及结构较为复杂。微生物菌群以霉菌为主,细菌次之,酵母菌相对丰度较低。在相对丰度排名前15的微生物中平坝窖酒小曲细菌类群相对丰度最高(属水平为38.73%,种水平为40.39%),远高于酵母菌和霉菌,其优势细菌为食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)、融合魏斯氏菌(Weissella confusa)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),优势霉菌为米根霉(Rhizopus oryzae)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)和横梗霉(Lichtheimia ramosa),优势酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和扣囊腹膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)。

基于单分子实时测序技术的3个当阳广椒样品细菌多样性研究

本文采集了3个鲊广椒样品,使用单分子实时测序技术对其细菌微生物多样性进行了评价。在属水平上,乳酸杆菌属(Lactobacillus)的相对含量为94.25%;在种水平上,相对含量大于1.0%的种分别为隶属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)的破布子乳杆菌(L.pobuzihii)、食品乳杆菌(L.alimentarius)、费斯莫尔德乳杆菌(L.versmoldensis)、类短乳杆菌(L.parabrevis)、短乳杆菌(L.brevis)、朝鲜乳杆菌(L.koreensis)和类食品乳杆菌(L.paralimentarius),其平均相对含量分别为32.31%、23.17%、22.01%、8.90%、3.31%、1.63%和1.05%,隶属于魏斯氏菌属(Weissella)的类肠膜魏斯氏菌(W.paramesenteroides)的平均相对含量为1.05%。在分类操作单元(Operational taxonomic units,OTU)水平上,发现6个核心OTU,包含的序列数占所有质控后合格序列数的29.58%。由此可见,当阳地区鲊广椒中的细菌微生物主要隶属于乳酸杆菌属(Lactobacillus),且样品间共有大量的核心菌群。

基因测序技术的研发现状及其在医药领域的应用

自第1代测序技术发现以来,基因测序技术发生了快速更迭,经历了高通量测序技术、单分子实时测序技术、纳米孔测序技术的发展变革,并不断推动着医药领域的发展。本文将系统综述基因测序技术的发展历程,总结各类技术特点、优势、劣势及代表性企业,介绍各类技术在医药领域应用场景,为基因测序技术未来发展提供重要参考。

枫香叶片变色期全长转录组测序及分析

枫香因其树形优美,入秋后叶色红艳或橙黄,极具观赏价值,是优良的景观生态树种。为了解枫香叶片变色及其次级代谢过程的遗传基础,该文以枫香5个叶片变色期叶片混合样品为材料,利用单分子实时测序技术(PacBio平台)对其进行全长转录组测序。结果表明:(1)全长转录组测序共获得41.04 Gb的高质量数据,从中鉴定出全长非嵌合序列563 180条,通过聚类和去冗余,获得27 269条高质量全长转录本。在27 269条全长转录本中预测到2 035条长链非编码RNA(lncRNA),并检测出14 892个简单重复序列(SSR)位点和1 856个转录因子。(2)基因注释结果表明,NR、GO、COG、KEGG等8个数据库共注释了24 857条转录本,KEGG数据库共获得了124个条代谢途径,主要有核糖体、碳代谢、氨基酸生物合成等,在类黄酮和叶绿素代谢途径中分别有49和71个转录本参与。上述结果初步揭示了枫香叶片变色期转录组信息以及功能特性,为后续研究枫香叶片变色分子机制、色素代谢合成途径和调控、相关功能基因克隆以及叶色改良提供基础数据。

九里香全长转录组测序分析

目的:获得九里香Murraya exotica L.Mant.全长转录组数据库,为深入挖掘其全长基因信息提供参考。方法:利用Pacino Sequel平台的第三代测序技术,对九里香的根、茎、叶、花、果混合样品进行全长转录组测序,并对原始转录组数据进行分析。结果:共获得94435个转录本,平均长度为76476.23 bp,80583条环形一致性序列,通过聚类、校正和去冗余后最终得到108443个高质量的isoforms,其中在非冗余蛋白(NR)、核苷酸序列(NT)、基因本体(GO)、真核生物相邻类的聚簇(KOG)、蛋白家族(Pfam)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)和SwissProt共注释了100219个isoforms,同时检测出34182个简单序列重复(SSR)位点,其中18482个单核苷酸数量占主导位置;检测了2574个转录因子,29592个长链非编码RNAs(lncRNAs)和30322个mRNAs。结论:获得了较为可靠的九里香全长转录组数据,为深入研究九里香的生长发育、相关代谢途径、功能基因利用、基原物种鉴定等提供数据参考。

基于SMRT测序技术的16S rRNA基因全长测序及其分析方法

被称为第三代测序技术的单分子测序是最近几年发展起来的高通量测序技术。其中,由Pacbio Bio Sciences公司开发的单分子实时测序技术(SMRT)是最先商用的技术。SMRT测序技术通过对模板序列循环测序产生环形一致序列(CCS),成功克服第三代测序技术准确率低的弊病。通过SMRT测序技术,科学家可以更深入准确地探究复杂环境微生物的结构和功能。介绍SMRT测序技术在微生物16S rRNA基因测序中的优势和劣势,并就基于SMRT测序技术所得的全长16S rRNA基因序列的质量控制、错误序列排除、聚类和注释分析等重要分析环节进行概述,同时,提出利用SMRT测序技术研究复杂环境微生物可能存在的问题及其解决方法,期望能为研究人员提供参考。

采用SMRT测序技术考察莲子的真菌群落多样性

目的 考察莲子中真菌群落的多样性。方法 采用单分子实时(SMRT)测序技术对莲子(红莲和白莲)中真菌的ITS全长扩增片段进行测序分析。通过评估测序数据、分析其α和β多样性,剖析真菌的组成、考察组间差异及菌属间的相关关系,剖析莲子的真菌群落结构。结果 共检测到1界、10门、30纲、75目、158科、247属和342种真菌,优势菌为Botryosphaeria wangensis(0~79.57%)、Lasiodiplodia laeliocattleyae(0.32%~49.18%)和Colletotrichum aenigma(0~31.76%)和Wallemia canadensis(0~22.86%)。有潜在致病风险的真菌为Colletotrichum aenigma、Aspergillus vitricola、Rhizomucor pusillus,存在产毒风险的真菌为Fusarium pernambucanum。红莲和白莲样品的真菌组成在组间存在显著性差异,差异菌主要是Botryosphaeria wangensis和Wallemia canadensis。结论 SMRT测序技术对研究莲子中真菌的多样性具有较好的适用性,并可通过分析产毒真菌的种类为莲子的安全使用提供风险预警。

番茄潜叶蛾马铃薯种群幼虫肠道细菌组成结构与多样性及功能预测

【目的】探究番茄潜叶蛾马铃薯种群幼虫肠道细菌组成结构与多样性及功能,为番茄潜叶蛾寄主适应性机制研究及综合防治提供理论依据。【方法】采用传统分离培养法和16S rDNA序列分析对取食马铃薯的番茄潜叶蛾肠道可培养细菌进行分离鉴定;采用单分子实时测序技术对其肠道细菌16S rDNA序列进行全长测序,分析肠道细菌的组成结构与多样性,并进行功能预测分析。【结果】番茄潜叶蛾马铃薯种群幼虫肠道细菌有5门13科13属15种,优势门、科、属、种分别为厚壁菌门(Firmicutes)、肠球菌科(Enterococcaceae)、肠球菌属(Enterococcus)和蒙氏肠球菌(E.mundtii)。其中通过传统分离培养法共分离到可培养细菌2门5科5属6种,优势门、科、属、种分别是厚壁菌门(90.38%)、肠球菌科(83.71%)、肠球菌属(83.71%)和蒙氏肠球菌(83.71%),桑肠杆菌(Enterobacter mori)(6.56%)、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)(5.98%)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)(2.30%)为细菌主要种类。通过单分子实时测序技术在番茄潜叶蛾肠道样品中共注释到5门6纲9目10科10属10种细菌,优势种是蒙氏肠球菌(70.71%),阴沟肠杆菌(E.cloacae)(22.16%)为细菌主要种类。番茄潜叶蛾肠道细菌ACE、Shannon、Simpson和Chao1指数分别为7.22±1.91、0.69±0.43、0.28±0.19和6.33±0.94。通过KEGG代谢途径分析,发现番茄潜叶蛾马铃薯种群的肠道细菌主要参与碳水化合物、氨基酸、核苷酸和能量等的代谢,优势种蒙氏肠球菌在碳水化合物代谢和膜运输中的作用最强。【结论】番茄潜叶蛾马铃薯种群幼虫肠道细菌种类较丰富,优势种为蒙氏肠球菌,其肠道细菌可能参与碳水化合物、氨基酸和核苷酸等代谢。

基于单分子实时测序(SMRT Cell)的南美番茄潜叶蛾幼虫肠道细菌多样性分析

【目的】为了弄清南美番茄潜叶蛾Tuta absoluta(Meyrick)幼虫肠道细菌的组成结构及多样性,为其综合防治研究提供理论依据。【方法】采用单分子实时测序技术(SMRT Cell)对南美番茄潜叶蛾3龄幼虫肠道细菌16SrDNA全长进行测序分析。【结果】从南美番茄潜叶蛾3龄幼虫肠道样本中共测得25903条Effective-CCS,聚类为134个OTU,共注释到14门22纲53目75科103属118种的细菌。其中,变形菌门(Proteobacteria)为优势菌门,占93.95%,欧文氏菌属(Erwinia)为优势菌属,占91.82%,Erwiniainiecta为优势种,占91.82%,其余种类的相对丰度均低于1%。南美番茄潜叶蛾3龄幼虫肠道细菌多样性指数ACE、Chao1、Simpson和Shannon指数分别为77.308±13.489、77.821±12.771、0.156±0.039和0.835±0.190。【结论】南美番茄潜叶蛾3龄幼虫肠道细菌的群落物种组成丰富,其中Erwiniainiecta为优势种。该研究结果可为南美番茄潜叶蛾幼虫肠道细菌功能的挖掘及该害虫综合防治研究提供理论依据。

基于PacBio SMRT测序技术分析食管癌特征性肠道菌群及其生物标志物

[背景]食管癌是常见的消化道肿瘤,中国是食管癌高发地区。有研究提示,肠道菌群与肿瘤等多种疾病的发生发展相关。受测序读长所限,传统的16S rDNA测序技术只能鉴定到属。[目的]本研究基于PacBio单分子实时(SMRT)测序技术在种水平筛选与食管癌相关的特征性微生物标志。[方法]招募首次诊断为食管癌的新发病例120例,和性别、年龄匹配的健康对照60例。采集所有研究对象的新鲜粪便样本。利用第三代测序PacBio SMRT技术对4例食管癌患者及1:1匹配的健康对照者样本进行16S rDNA全长测序,基于测序结果分析其肠道菌群结构差异。采用PICRUSt软件进行功能预测。通过线性判别分析和群落差异分析筛选差异肠道微生物进行大样本人群验证,识别食管癌相关肠道微生物。[结果]基于测序样本,α多样性分析中食管癌组的Ace、Chao1、Simpson Diversity、Shannon Wiener指数均高于健康对照组(P<0.05),β多样性分析显示食管癌组和健康对照组散点簇分离,二者肠道菌群结构存在差异。在门水平上,食管癌组肠道菌群中变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门丰度升高。在属水平上,食管癌组毛螺旋菌属、巴氏杆菌属、罗斯氏菌属和拟杆菌属相对丰度增加。在种水平上,食管癌组相对丰度增加的微生物是肠杆菌E.20、卵形拟杆菌V975、普氏栖粪杆菌等11种,丰度降低的微生物是皮氏罗尔斯通氏菌、肠杆菌未分类、唾液链球菌JIM87773种。PICRUSt功能注释后发现食管癌组与健康组在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(map00250)、肽聚糖生物合成(map00550)、叶酸一碳单位库(map00670)、硫胺素代谢(map00730)、氨基酸的生物合成(map01230)通路上存在差异。对验证人群的分析结果显示,与健康对照人群相比,食管癌人群的肠杆菌E.20、马赛拟杆菌的丰度升高,唾液链球菌JIM8777的丰度降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。建立受试者工作特征分析发现,肠杆菌E.20、唾液链球菌JIM8777、马赛拟杆菌联合诊断的曲线下面积(AUC)为0.779,高于单一诊断结果(AUC分别为0.610、0.608、0.659)。[结论]食管癌组的肠道菌群与健康对照组存在差异。肠杆菌E.20、唾液链球菌JIM8777、马赛拟杆菌的联合应用对食管癌的诊断具有潜在应用价值。

SMRT测序技术在6例平衡易位断裂点检测中的应用

目的探索三代单分子实时(single molecule real time,SMRT)测序技术在胚胎植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing,PGT)领域阻止染色体平衡易位向子代传递的应用价值。方法2021年1月至2021年6月期间在空军军医大学唐都医院妇产科生殖医学中心利用三代SMRT测序技术,对6对夫妇中染色体平衡易位携带者的外周血全基因组进行测序,鉴定平衡易位断裂点并构建断裂点附近的单体型,然后通过PGT对胚胎染色体非整倍性及结构进行检测,获得完全正常的胚胎进行移植。结果通过全基因组三代SMRT测序检测到了平衡易位断裂点并且精确到单碱基水平;6对参与实验的夫妇通过对移植前的囊胚检测,均明确断裂点位置,最终5对夫妇获得完全正常的胚胎。结论三代SMRT测序技术可在全基因组范围内将携带者的平衡易位断裂点精确至单碱基水平,可应用于PGT领域阻断染色体平衡易位向子代的传递。

海南地区健康青年肠道中乳酸菌和双歧杆菌多样性研究

目的:在种的水平揭示海南地区健康青年肠道中乳酸菌和双歧杆菌的丰度和生物多样性,探讨性别、年龄和BMI对上述两者可能的影响。方法:以海南地区27名健康志愿者为研究对象,将乳酸菌特异性引物和双歧杆菌特异性引物扩增与PacBio SMRT测序技术相结合,采用相关生物信息学与统计学方法分析。结果:志愿者肠道中乳酸菌主要由链球菌属、乳杆菌属、魏斯氏菌属、瘤胃球菌属等组成。按照乳酸菌在种水平的组成,所有人群可以分为两个肠型,两个肠型人群唾液链球菌的比例存在显著差异(P<0.05)。此外,男性志愿者肠道中乳酸菌丰度和多样性显著高于女性。依据肠道双歧杆菌多样性特征,可将志愿者分为以链状双歧杆菌、长双歧杆菌、粪双歧杆菌为优势菌的3个类群,性别和BMI均是对双歧杆菌组成产生影响的因素。结论:青年人群肠道中具有丰富的乳酸菌和双歧杆菌,其构成与个人饮食习惯、性别和BMI有一定相关性,肠道中优势乳酸菌和双歧杆菌对人体健康发挥着重要作用。

细菌DNA甲基化研究进展

DNA甲基化修饰是细菌调控基因表达的一种重要方式,在很多生理过程中发挥非常关键的作用.本文系统介绍了细菌DNA甲基化修饰的起源、DNA甲基转移酶,分类总结了DNA甲基化调控基因表达的机制.同时对近年来细菌DNA甲基化的功能、DNA甲基化检测方法的进展进行了综合评述.这些研究对人类了解细菌DNA甲基化表观调控及控制细菌感染具有重要指导意义.

健康蒙古族人肠道中乳酸菌和双歧杆菌多样性

【背景】越来越多的研究发现人类的诸多疾病与肠道菌群失衡有关。乳酸菌和双歧杆菌属于肠道中的有益菌,在不同人群肠道中的多样性不尽相同。【目的】在种水平上分析健康蒙古族人群肠道菌群中乳酸菌和双歧杆菌的多样性。【方法】以27名健康蒙古族志愿者为研究对象,其中14名来自中国内蒙古,13名来自蒙古国。首次采用乳酸菌和双歧杆菌的特异性引物扩增与PacBioSMRT三代测序技术相结合,在种水平上探讨志愿者肠道中乳酸菌和双歧杆菌的丰度和生物多样性,并进一步分析性别、BMI(Bodymassindex)值和地域对上述两者可能的影响,以及优势菌种之间的相关性。【结果】在种的水平上,27名志愿者肠道样品中共鉴定到68个乳酸菌和11个双歧杆菌,其中平均相对含量在1%以上的乳酸菌有8个,包括唾液链球菌(Streptococcus salivarius,36.41%)、瘤胃乳酸杆菌(Lactobacillus ruminis,17.94%)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii,3.11%)、罗氏乳杆菌(Lactobacillus rogosae,2.23%)、轻型链球菌(Streptococcus mitis,2.18%)、阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis,2.02%)、魏斯氏乳杆菌(Weissella confusa,1.54%)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus,1.09%);双歧杆菌有5个,包括青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis,39.88%)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum,27.15%)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum,26.30%)、两歧双歧杆菌(B. bifidum,3.92%)和角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum,1.71%),聚类分析分为链状双歧杆菌和青春双歧杆菌2个主要的类群。分析结果显示:性别、BMI值和地域均未能显著影响志愿者肠道中乳酸菌和双歧杆菌的菌群结构(P>0.05),但男性和女性之间、中国内蒙古地区和外蒙古国的志愿者之间的个别乳酸菌菌种相对含量存在显著差异(P<0.05)。对样品中的优势乳酸菌和双歧杆菌进行Spearman相关性分析发现,乳酸菌和双歧杆菌彼此之间相关性较为密切,不同菌种间相关性不尽相同,与具体的菌种有关。【结论】首次采用PacBio SMRT测序技术在种的水平揭示了健康蒙古族人肠道中乳酸菌和双歧杆菌菌种多样性,为在种水平上解析肠道中乳酸菌和双歧杆菌多样性提供了新的研究思路和实施方案。

Single molecule, real-time sequencing technology improves the sensitivity for detecting bacteria in koumiss, a traditional fermented mare milk product

Food fermentation has a long history in China[1].Traditional fermented dairy products contain an array of natural microbes and some of them exert desirable health effects[2].There is a growing interest in identifying specific health-promoting microbes present in the fermented dairy products[3].