中国科研团队攻克分子筛酸中心表征的单分子成像技术

近日,清华大学鄂尔多斯实验室魏飞教授研究组和骞伟中教授研究组联合攻关,利用国际上最先进球差校正电镜技术,观察到分子筛孔道中酸性位(Al-T位点)与噻吩单分子的相互作用。相关成果已先后发表于国际学术期刊《科学》和《自然》。研究有机小分子在以分子筛为代表的多孔材料中的单分子成像与构象,是深入理解其相变、吸附、催化和相互作用过程的基础与关键。其中,有机小分子在室温或更高温度下的成像,一直是电子显微学领域难以攻克的关口。

单分子成像和追踪技术在工业微生物研究中的应用

在单分子工具和技术的迅速发展过程中,单分子荧光显微镜技术脱颖而出,可以高特异性地监测荧光标记的生物分子的时空行为,成为研究生物系统的有力工具。然而,单分子成像和追踪技术在工业微生物研究及酶工程领域中的应用仍处于起步阶段。随着生物工程技术、合成生物学和代谢工程等科学技术的迅猛发展,工业微生物的应用日趋广泛。但是,菌株往往难以在整个培养期间保持最大的生产能力,导致在经济效益上不能满足产业化的需求,成为制约微生物细胞工厂发展的一个瓶颈,对酶学研究提出新的挑战。单分子成像和追踪技术具有直接、准确、实时等监测优点,可以直接在活体生物上进行研究,成功地实现了对单分子酶催化过程的实时监控,发现了多种酶的新单分子行为及反应机制。这些技术有助于各种新型酶、新特性酶、新作用方式酶的研发。本文简述单分子成像和追踪技术的主要特点(以荧光显微镜为主),总结近年来单分子成像和追踪技术在微生物研究、酶学研究中的应用,及其在工业微生物研究中的应用现状和面临的挑战。这些技术的应用必将促进纳米生物学的发展,推动酶工程改造,提高细胞工厂的生产能力。

单分子成像和追踪技术

单分子成像和追踪技术实现了在分子水平上对细胞内部结构和生命活动的直接可视化和原位测量,深化了对生物过程及其机理的理解,促进了各种新型酶、新特性酶、新作用方式酶的研发。目前,单分子成像和追踪技术在工业微生物研究中的应用尚处缶起步阶段,在实际应用中仍面临诸多挑战。为此,《广西科学》本期邀请广西科学院生物中心研究员严少敏、吴光撰写此篇综述,分析这些新技术在+业微生物研究中的应用现状及存在问题,以提升酶工程改造的创新能力,促进绿色制造的发展。

腺相关病毒感染途径的实时单分子成像分析

在病毒感染途径研究中,由于电子显微镜不能长时间用于研究活细胞,而常规荧光显微镜技术所需病毒量大,且标记要求高,一些实验因素常可能干扰病毒-细胞间相互作用,因此相关研究技术亟待突破。本方法首次在单分子成像基础上,用单个荧光染料分子Cy5标记腺相关病毒(AAV)。

细胞膜上信号转导蛋白的单分子成像与分析

结合本课题组的研究工作,介绍了单分子荧光成像原理、荧光标记方法及数据分析方法,并进一步综述了单分子荧光成像在几种重要的膜蛋白信号转导分子机制和相关药物研究中的进展.

基于单分子成像技术研究λ-DNA分子穿越微米通道端口的电动力学特性

操控单个DNA分子,将其有效引入、导出微纳通道是实现DNA生物芯片功能的前提条件.本文利用单分子荧光显微成像技术系统地实时观察分析λ-DNA单分子在电场力驱动下进入/穿出50μm通道端口处的电动力学特性及规律.研究发现:λ-DNA分子能够顺利进入trans端口并穿出cis端口,外加电场强度存在最大(Emax)和最小(Emin)阈值,只有场强E满足:Emin≤E≤Emax时, λ-DNA分子才能进入trans端口并顺利穿出cis端口;当电场强度小于最小阈值场强时, DNA分子不能进入trans端口;当电场强度大于最大阈值场强时, λ-DNA分子虽可能从trans端口进入通道内部,但不容易从cis端口穿出,而是在迁移至通道内cis端口附近时,运动方向反转、往复、甚至旋转等新现象,并且易于粘附到管壁上;随着场强增大,反转位置距cis端口越大.基于微流体电动力学理论,对λ-DNA分子在微通道端口的不同运动状态的物理机制进行了初步分析.本研究结果对研制基于微纳通道系统的基因芯片实验室及DNA分子传感器具有一定的实际指导意义.

mRNA单分子动态成像技术研究进展

转录后成熟的mRNA与RNA结合蛋白结合,形成信使核糖核蛋白复合物,之后在胞质内沿细胞骨架转运并定位到亚细胞特定区域。在此过程中,mRNA的转运及调控对于mRNA的功能、蛋白质的定位和细胞极性生长的维持发挥着重要的作用。近年来,活细胞单分子成像技术的发展,为人们深入了解mRNA的动态调控提供了新的契机。通过对活细胞中mRNA和RNA结合蛋白的标记,我们不仅可以检测mRNA的动力学特征,还可以原位检测新合成的蛋白质。本文主要介绍mRNA的定位和翻译过程,重点叙述单分子动态成像技术在分析mRNA动态调控中的应用。活细胞单分子成像技术可以揭示mRNA翻译的动力学特性,并促进我们对mRNA命运的理解,为后续研究mRNA的动态调控提供参考。

光热显微术:基于光吸收的单分子成像技术

光热显微术是近年来获得广泛关注和长足发展的一种新型光学显微成像技术,能够实现单个纳米粒子甚至单分子的免标记光学成像。其成像原理是利用先进的光学方法探测单分子或单纳米粒子吸收特定波长激发光后所产生的局域温度和介质折射率的微小变化,从而定量研究观测对象的光热特性。由于无辐射弛豫是激发态分子回到基态的优势过程,分子的光热特性相比于荧光特性更具有普遍意义。凭借无需标记、高灵敏度和信号稳定等优点,近十年来,关于单分子和单纳米粒子的光热显微成像研究不断取得突破,并在纳米科学和生命科学等领域获得越来越多的发展和应用,展现出了蓬勃的生命力和良好的发展前景。本文重点综述了光热显微技术的成像原理、发展历程、技术特色以及系统优化方法,列举了光热成像在活细胞研究和生物学领域的应用,最后总结了光热成像的优缺点并分析其主要面临的挑战以及未来的发展趋势,希望吸引更多的研究人员加入到这一新技术的研究队伍中来。

RNA聚合酶动态调控DNA转录的单分子水平研究进展

真核生物的RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)和原核生物的RNA聚合酶(RNAP)主要负责转录合成信使RNA(mRNA),调控不同基因的转录水平,以调节生物体的生长发育和应对复杂多变的环境。研究者采用传统的荧光显微镜观测到RNAP可形成团簇,据此针对DNA转录调控提出“转录工厂”模型。随着单分子技术的发展,研究者在单分子水平上观测到了活细胞中RNAP动态调控DNA转录,提出RNAP可以通过液-液相分离机制进行转录调控。该综述总结了不同单分子荧光显微镜的技术原理,以及相关的荧光探针标记方法,并介绍了在真核生物和原核生物中应用单分子成像技术可视化RNA聚合酶动态调控DNA转录过程的研究进展,最后展望了单分子技术在转录调控研究中的应用前景。

化学所在细胞信号转导相关蛋白的单分子实时成像方面取得重要进展

化学研所分子纳米结构与纳米技术院重点实验室研究人员在国家自然科学基金委重大研究计划、科技部纳米科学重大科学研究计划和中科院等相关项目的支持下，近期与清华大学生物系合作，通过活细胞单分子成像，在转化生长因子受体聚集状态和激活模式的研究方面取得重要进展。

单分子成像显示视网膜血管内皮细胞膜上血管内皮生长因子受体2聚集状态

目的观察单个视网膜血管内皮细胞膜上血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的聚集状态。方法将猴视网膜血管内皮细胞(RF/6A)分为空白对照组(正常培养)、质粒转染组[转染VEGFR2-绿色荧光蛋白(GFP)重组质粒]。采用共聚焦显微镜观察质粒转染组GFP的表达;实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中VEGFR2的mRNA和蛋白表达情况;单分子成像技术记录细胞膜上表达的单个VEGFR2-GFP分子的荧光强度分布和漂白步数,判断受体的寡聚或多聚状态。结果共聚焦显微镜观察发现,转染12 h后,质粒转染组细胞可见GFP绿色荧光。qPCR检测结果显示,质粒转染组细胞中VEGFR2、GFP mRNA表达较空白对照组显著升高,差异均有统计学意义(t=11.240、12.330,P<0.001、0.001)。Western blot检测结果显示,质粒转染组细胞VEGFR2蛋白表达较空白对照组增强,差异有统计学意义(t=8.346,P<0.01)。单分子成像结果显示,无配体刺激时RF/6A细胞膜表面上VEGFR2-GFP的荧光强度分布为双峰,其中单体、二聚体比例分别为86.0%、14.0%;通过计数GFP荧光漂白步数,静息状态下受体单体、二聚体、三聚体和四聚体比例分别为81.4%、12.9%、5.5%、0.3%。结论无配体状态下,VEGFR2在RF/6A细胞膜表面以单体和包括二聚体在内的多聚体形式共存,以单体为主。

单分子免疫成像

在中心法则崩溃后的混乱中，作为一项分析分子功能的技术——单分子成像备受关注。为发挥这项革新技术的威力，日本遗传研究所教授，理化深感空气 研究小组负责人德永万喜洋选择了免疫作为研究的领域，并取得了成果。

单分子实时成像和表征研究进展

中国科学院化学研究所分子纳米结构与纳米技术实验室研究人员近期与清华大学生物系合作，通过活细胞单分子成像．在转化生长因子受体聚集状态和激活模式的研究方面取得重要进展，相关研究成果发表于2009年106卷美国《国家科学院院刊》上。

单分子实时成像和表征研究获进展

中国科学院化学研究所分子纳米结构与纳米技术实验室研究人员近期与清华大学生物系合作，通过活细胞单分子成像，在转化生长因子受体聚集状态和激活模式的研究方面取得重要进展，相关研究成果发表于2009年106卷美国《国家科学院院刊》上。

单分子定位超分辨显微成像有机荧光探针的研究进展

在生物医学领域,对纳米尺寸级别的微小生物目标进行精确定位研究具有非常重要的意义,而光学显微成像技术为此提供了强有力的工具。光学显微成像技术受到光学衍射极限的限制,难以分辨尺寸在衍射极限(<200 nm)以下的生物结构,无法直接获取微小生物结构信息,阻碍了生物医学的进一步发展。近年来,随着纳米分辨显微成像技术的出现,新型荧光探针的开发、成像系统与设备的不断发展及成像算法不断完善地深入结合,促进了光学衍射极限以下尺寸微观目标的研究。基于单分子定位的超分辨荧光显微成像(SMLM)包括光激活定位成像(PALM)与随机光学重构超分辨成像(STORM),将有机荧光探针与超分辨光学显微成像技术紧密结合在一起,荧光探针的光物理性质直接决定着超分辨成像结果的好坏。因此,设计不同性能的荧光探针可以实现超精细结构的不同超分辨成像,为研究其生物学功能提供了有力的工具。本文着重围绕基于SMLM的原理、有机荧光探针的设计要求、用于SMLM的荧光探针种类及其生物应用等方面进行总结综述,指出了单分子定位成像上存在的不足,并对其发展方向进行了展望,希望为对超分辨成像研究感兴趣或初涉该领域的研究者提供成像理论与探针设计方面的帮助。

原子力显微镜在蛋白单分子结构与功能研究中的应用

原子力显微镜(AFM)以其超常的信噪比、空间分辨率和灵活的探测环境使得单个蛋白分子能在生理条件下成像,在蛋白单分子结构与功能研究中得到广泛地应用。论文介绍了AFM在分子马达、光合蛋白、分子伴侣等蛋白表面结构表征中的应用;AFM在蛋白单分子表面的粘弹性、电荷分布、分子间相互作用等物理属性研究中的进展;总结了AFM在蛋白分子功能研究和单分子操纵中的应用。

DNA损伤修复的单分子水平研究进展

外源或内源的DNA损伤在生物体内持续发生。DNA损伤修复的缺陷与很多疾病甚至癌症等息息相关,而生物细胞进化出一系列精密的修复机制以耐受或切除这些损伤。单分子技术区别于常规的生化、分子生物学等手段,可以在体外和活细胞内研究DNA修复相关生物分子的动态反应特征,从而对DNA修复机制进行更充分的剖析。文章围绕常见的DNA损伤及其修复类型,阐述了近年来利用原子力显微镜、磁镊、光镊等单分子操控技术,以及全内反射荧光显微镜、光激活定位显微镜和超分辨显微示踪等单分子荧光成像技术在DNA修复机制研究中取得的进展,梳理了利用单分子技术解决的长期存在的关于DNA修复难题,并展望了单分子技术联合其他交叉学科技术在研究DNA修复机制方面的前景。

功能分子结构的组装和单分子物性:基于密度泛函理论的第一性原理计算与扫描隧道显微学(I)

在单个分子的层次上研究低维分子纳米结构的生长,理解组装机制并实现结构与特性的有效控制,是低维体系物理及其器件研究的重要内容。本文在基于密度泛函的第一性原理计算的基础上,对功能分子在金属表面上的自组装特性等进行了综述。对理论方法作了简要介绍后,综述了第一性原理计算方法在研究金属基底上分子自组装结构、界面特性、结构控制、单分子成像机制、单分子量子调控以及单分子输运性能等方面的应用。最后对基于密度泛函的第一性原理计算在解释功能分子组装与界面物理化学特性方面的发展前景进行了展望。

单分子中心定位精度与信噪比关系及中心定位算法改进研究

本文从理论和实验两个角度研究单荧光分子中心定位精度与信噪比的关系,提供了一种相对简单的方法来确定基于单分子中心定位技术的超高分辨显微成像系统的分辨率。特别是,本文给出一种提高定位精度的像素重建算法,在信噪比等条件不变的情况下,该算法可有效改善单分子定位精度,从而提高超高分辨成像系统的分辨率。

单分子纳米生物技术

生物分子需要相互协调组成各种分子机器,例如:分子马达、细胞信号处理器、DNA转录机、蛋白质合成器等,来实现他们负责的各种生理功能。一方面,这些分子机器的功能对于环境改变有着很强的适应性,这种适应性对于生物体和生物系统的稳定来说是必须的。另一方面,由于分子机器的大小只有几纳米并且结构具有可变性,它们的运转倾向于受到热扰动的影响具有随机性,此外,分子机器所利用的输入能量的水平与平均热运动能量k_BT近似,分子机器可以高效地将热噪声的能量转化利用于行使其功能,对于这些能量的利用效率也很高,这与人造机器运转所需能量远远高于热运动能量相比有着十分显著的差别。因此,分子机器的潜在机理比人造机器复杂了许多。近些年来,随着单分子探测技术和纳米技术在生命科学的各个领域的广泛应用,使得生物分子的动力学性质,以及以往被隐藏在系综平均结果后的单个分子机器运转规律逐渐被揭示。我们研究的目标是希望通过揭示分子机器的独特运转规律进而能够了解、掌握具有适应性的生物系统中包含的工程学原理。本文综述了我们所作的一些关于分子马达、酶促反应、蛋白质动力学和细胞信号转导的单分子探测试验,并且讨论了热涨落(噪声)是怎样在具有独特的运转规律的生物分子机器中起到正效应,进而允许生物系统具有可变性和适应性的。