鲨鱼单域抗体融合蛋白的克隆表达、稳定性及检测性能研究

目的探究鲨鱼单域抗体融合蛋白的克隆表达及其性能。方法通过大肠杆菌表达系统高效表达鲨鱼单域抗体融合蛋白2E6-SUMO;以传统的免疫球蛋白G(immolunoglobulin G,IgG)抗体为对照,对其热稳定性及酸碱稳定性进行研究;并以2E6-SUMO为识别元件,建立间接竞争酶联免疫吸附法,并应用于水产品中恩诺沙星残留的检测。结果2E6-SUMO的可溶性表达量为1.67mg/L,与传统的IgG抗体相比,2E6-SUMO具有更好的热稳定性和酸碱稳定性;建立了基于2E6-SUMO检测恩诺沙星的间接竞争酶联免疫吸附法,半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))为42.08ng/mL,检出限为3.84ng/mL,线性范围为9.94~376.17 ng/mL;鱼肉基质对2E6-SUMO没有显著干扰,加标样品的回收率在83.33%~123.06%之间。结论鲨鱼单域抗体融合蛋白实现了高效表达,表现出更好的稳定性,可作为一种新型特异性免疫元件用于水产品中药物残留的免疫检测。本研究为鲨鱼单域抗体融合蛋白的应用提供了参考。

单域抗体全球专利简析

单域抗体指由抗体或新抗原受体单一可变结构域构成的具有抗原结合活性的基因工程抗体。由于其分子量小、稳定性好和抗原亲和力高的特点,现已成为抗体工程领域的研究新热点。到目前为止,全球约有30个单域抗体临床项目正在开展中。在Incopat数据库中通过关键词和IPC分类号检索,分析单域抗体相关专利的申请趋势、地域分布、申请人和技术领域分布等,对全球单域抗体的研发基本概况和覆盖靶点等进行了初步探讨,以了解该领域的发展脉络和趋势,为国内创新主体提供指引。

GSDMD单域抗体的筛选及功能探究

目的:筛选并验证gasdermin D(GSDMD)单域抗体(single-domain antibody,sdAb)及其生物学功能。方法:利用原位邻近连接分析(in situ proximity ligation assay,is PLA)结合高通量测序筛选抗GSDMD sdAbs候选序列;利用is PLA、Co-IP、GST pull down、等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry,ITC)验证这些sdAbs与GSDMD的特异性结合;在脂多糖(LPS)和nigericin处理的细胞焦亡模型中,观察细胞表型变化;检测细胞上清液中白细胞介素1-β(IL-1β)水平变化以及乳酸脱氢酶(LDH)的释放;通过Western印迹检测经上述处理后的细胞中GSDMD以及GSDMD N端结构域(GSDMD N terminus,GSDMD-NT)量的变化。结果:通过is PLA结合高通量测序方法筛选出GSDMD sdAb的候选序列,其中sdAb#26与GSDMD C端结构域(GSDMD C terminus,GSDMD-CT)相互作用;与sdAb Con对照组相比,sdAb#26处理高表达GSDMD细胞产生焦亡表型的细胞显著增多;细胞上清中释放的IL-1β以及LDH显著提高(t=68.54,P<0.001;t=5.909,P<0.01);GSDMD-NT产生量显著增加。结论:GSDMD sdAb具备操控GSDMD介导焦亡的潜力,为焦亡相关疾病的治疗提供了新思路。

Java Web框架动态表单域编程在物业管理中的应用

主要介绍在Java Web框架下如何应用FreeMarker和WebWork技术来实现动态表单域的编程,并阐述FreeMarker和WebWork组合的优势。

抗AFB_1单域重链抗体文库淘选方法的研究

比较两种从噬菌体展示文库中淘选抗黄曲霉毒素B1单域重链抗体的方法,并为淘选针对小分子物质的单域重链抗体提供参考。采用固相淘选技术,以黄曲霉毒素B1人工抗原为靶分子,淘选天然单域重链抗体库,分别采用Gly-HCl法和AFB1竞争法洗脱结合噬菌体,对洗脱物进行滴度测定,以回收率和富集度为指标,对两种洗脱方法进行比较。采用phage-ELISA法鉴定噬菌体克隆,并对阳性克隆进行交叉反应分析以及序列测定。滴度测定结果显示,Gly-HCl法回收率比竞争法高5～10倍。分别随机挑取20个单克隆进行phage-ELISA鉴定,其中,Gly-HCl洗脱法未获得阳性克隆,AFB1竞争洗脱法得到8个阳性克隆。序列测定结果显示,这8个克隆均编码单域重链抗体。

对一个CDR区发生突变的改形抗CD28重链单域抗体的研究

在构建改形抗CD2 8重链单域抗体时 ,得到一个具有较高免疫学活性的改形抗CD2 8重链单域抗体基因序列。其推导氨基酸序列与改形构建时所选的人源抗体的FRs同源性最高 ;其推导氨基酸序列与鼠源抗CD2 8单克隆抗体重链可变区氨基酸序列比较发现 ,该改形抗体在CDR2区 53位缺失Ala氨基酸残基 ;而在 65a位上插入一个Arg氨基酸残基。在CDR3区缺少Asp95,Lys96,Gly97,Tyr98氨基酸残基。在FR3区缺少Lys82a ,Ser82b ,Leu82c氨基酸残基。由于该序列发生的突变较大 ,作者进一步对其进行了研究。该改形抗CD2 8VH 单域抗体基因与人c myc及人IgG3’CL绞链区基因在大肠杆菌中融合表达。融合表达包涵体经复性 ,纯化处理后 ,仍具有较高与人CD2 8分子结合活性。

一种构建改形单域抗体的方法(英文)

为验证一种构建改形单域抗体的实用新方法 ,与以往方法不同的是 ,该方法不需要对抗体进行空间结构模拟 ,以确定人源抗体的FRs接受序列及在人源FRs接受序列中哪些氨基酸残基需要突变 ,并且该方法将抗体的改形与亲和力成熟于同一过程完成。利用该方法构建了改形抗CD2 8重链单域抗体。根据一种鼠源抗CD2 8重链单域抗体的氨基酸序列 ,于GenBank中查得两条与之最同源的人源抗体序列 ,利用其中一条的FRs作为改形抗体的主框架进行改形构建。将鼠源抗体的CDR区插入到人源FR区后 ,对人源FR区的一些氨基酸残基进行替换突变 ,替换的氨基酸残基数及替换原则主要是根据对查到的人源抗体序列、鼠源抗体序列 ,以及这些序列与Kabat分类中的种属序列进行的比较。为了增加改形抗体基因的多样性 ,对要被替换的氨基酸残基在基因合成中采用简并的方式 ,使要被替换的氨基酸残基和替换的氨基酸残基都有机会出现 ,二者出现的几率各为 5 0 %。同时 ,在将大小不同的合成核苷酸片段采用重叠PCR扩增以获得完整改形抗体基因时 ,采用高Mg2 + 浓度下和使用TaqDNA聚合酶 ,以进一步随机引入突变。利用重叠PCR产物构建了一个噬菌体抗体库 ,经过 3轮淘选后 ,获得了几个具有较高免疫学活性的改形抗体。对其中的两个抗体进行了进一步研究 ,将?

半巢式PCR法构建天然噬菌体单域重链抗体文库

目的:构建天然噬菌体单域重链抗体文库,淘选可应用于食品安全检测的单域重链抗体。方法:以未经免疫的健康羊驼(Lama pacos)外周血为起始材料,提取RNA反转录为cDNA,根据重链抗体保守序列设计引物,通过半巢式PCR法扩增获得全套重链抗体可变区编码基因,将其克隆至噬菌粒pHEN1,电转化大肠杆菌TG1得到初级抗体库,辅助噬菌体KM13感染后得到噬菌体展示库。采用固相淘选法分别对3种人工抗原进行淘选。结果:单域重链抗体编码基因得到有效扩增,经10次电转化获得初级文库,命名为SNAL,实际库容量达到1.6×107个独立克隆,菌落PCR鉴定结果表明,克隆效率约为87%,辅助噬菌体救援后得到的展示文库命名为SNA-PDL,滴度达1013CFU/mL。对3种不同人工抗原DON-MBSA、NOR-BSA和AFB1-OVA的淘选均有富集现象。结论:构建了天然噬菌体单域重链抗体文库,文库的多样性较好,可以用于后续淘选。

抗前列腺特异抗原重链可变区单域抗体基因的构建及表达

目的 扩增出抗前列腺特异抗原 (PSA)单克隆抗体(MAb)的重链可变区 (VH)单域抗体基因 ,并在大肠杆菌中表达 .方法 从分泌抗 PSA m Ab的杂交瘤细胞系 E4B7中提取总 RNA,经 RT- PCR扩增 VH 单域抗体基因 ,将其克隆到融合蛋白表达载体 p GEX- 4T- 1中进行表达 .结果 VH 单域抗体基因全长 36 3bp,含起始码和终止码 .将其克隆到p GEX- 4T- 1内 ,转化大肠杆菌 DH5 α,获得高效表达 ,表达量占全菌总蛋白质的 38% ,以包涵体形式存在 .经初步纯化和复性后 ,用谷胱甘肽 (GST)亲和色谱纯化 ,再经凝血酶水解获得抗 PSA VH 单域抗体 .竞争结合抑制实验证明 ,该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性 .结论 构建成功抗 PSA的 VH单域抗体 。

抗人γ-精浆蛋白V_H单域抗体基因的构建、表达及空间构象分析

目的 扩增出抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)单克隆抗体 (mAb)的重链可变区 (VH)单域抗体基因 ,并进行原核表达及空间构象分析。方法 从分泌抗γ SmmAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA ,经RT PCR扩增VH 单域抗体基因 ,将其克隆到融合蛋白表达载体 pGEX 4T 1中进行表达 ,并利用计算机软件对表达产物进行空间构象分析。结果 VH 单域抗体基因全长 363bp ,含起始码和终止码。将其克隆到 pGEX 4T 1内 ,转化大肠杆菌DH5α ,获得高效表达 ,表达量占全菌总蛋白质的 38% ,以包涵体形式存在。经初步纯化和复性后 ,用谷胱甘肽 (GST)亲和色谱纯化 ,再经凝血酶水解获得抗γ SmVH 单域抗体。竞争结合抑制实验证明 ,该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性。空间构象分析结果显示 ,该抗体具有完整的抗原结合位点。结论 构建成功抗γ Sm的VH 单域抗体 ,为进一步临床应用奠定基础。

抗人卵巢癌单域抗体V_H 基因的克隆、表达及放射免疫显像

为研究小分子抗体作为导向载体的作用 ,制备抗人卵巢癌单克隆抗体COC1 83B2 单域抗体(重链可变区 ,VH) ,并进行放射免疫显像 (RII) .利用PCR技术从COC1 83B2 杂交瘤细胞中扩增COC1 83B2 的VH 基因片段 ,并将其克隆入高效表达载体pTHA90中 .重组子转化大肠杆菌TOP10 ,IPTG诱导表达VH 融合蛋白 ,经改进氯化亚锡法进行锝 ( 99mTc)的标记 ,在卵巢癌裸鼠皮下瘤模型上进行RII.结果表明 :( 1 )VH 融合蛋白以包涵体形式获高效表达 ;( 2 )改进氯化亚锡法成功进行VH 融合蛋白99mTc的标记 ,标记率达 96%以上 ;( 3)用99mTc标记VH 融合蛋白进行RII,肿瘤显像早 ,图像清晰 .说明99mTc可用于小分子抗体标记 ,应用单域抗体VH

抗DON单域重链抗体序列分析及三维建模与对接

探讨应用分子模拟与对接技术预测抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)单域重链抗体(DONIV2)的三维结构及其与DON的结合模式。采用生物信息学相关工具和网站分析预测DONIV2的理化特性及其二级结构,同源建模方法获得三级结构,然后采用分子对接软件Autodock 4.2将三维结构模型与DON进行分子对接。二级结构和三级结构分析显示,DONIV2由10个β片层结构组成,CDR区为无规则卷曲结构,位于分子的一端,在CDR1、CDR2与CDR3之间形成1条宽度约为1.2 nm的凹槽结构。对接结果显示,可能的DON结合位点由Arg59、Arg103和Arg105等残基组成,他们位于CDR2和CDR3区域。表明通过分子模拟与对接相关工具获得了DONIV2的一、二、三级结构及可能的结合活性位点,为深入认识DON与抗体相互作用机理提供了理论指导,并为下一步DONIV2体外亲和力的成熟提供了线索。

抗人γ-精浆蛋白V_H单域抗体/人p53四价功能域融合基因的构建及空间构象分析

目的 构建抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)重链可变区 (VH)单域抗体 /人 p5 3四价功能域融合基因 ,并进行空间构象分析。方法 选用人IgG3上游铰链区作为抗体和人p5 3四价功能域之间连接的linker。利用回归PCR法扩增人IgG3上游铰链区与人p5 3四价功能域融合基因 ,并在融合基因 5’端和 3’端引入SalⅠ与HindⅢ酶切位点 ,将融合基因克隆入 pUC1 9载体中构建pUC1 9/IgG3 /p5 3克隆载体。将抗人γ SmVH 单域抗体克隆入 pUC1 9/IgG3 /p5 3载体中 ,构建抗人γ SmVH 单域抗体 /人 p5 3四价功能域融合基因。经酶切鉴定及序列测定证实后 ,利用计算机软件进行空间构象分析。结果 获得了抗人γ SmVH 单域抗体 /人 p5 3四价功能域融合基因 ,基因全长 5 2 8bp ,可编码 1 76个氨基酸 ,与已发表的抗人γ SmVH 单域抗体、人IgG3上游铰链区和人p5 3四价功能域基因cDNA序列一致。计算机软件分析结果显示 ,融合基因表达产物可自动装配成四聚体抗体 ,并具有四条长的、柔性好的多肽 ,可确保每个抗体空间构象的独立性。结论 构建成功四价抗人γ SmVH 单域抗体 ,为进一步临床应用奠定基础。

基于重链抗体构建的单域抗体研究进展

在骆驼血清中存在天然的缺失轻链的重链抗体(heavy chainantibody ,HCAb) ,克隆重链抗体的可变区构建的只由一个重链可变区组成的单域抗体称为VHH抗体(variabledomainofheavychainofheavy chainantibody ,VHH)。研究发现,VHH抗体具有易表达、可溶性好、稳定性强等优点。另外,骆驼的重链抗体与人VH3家族抗体同源,对人VH3家族抗体的重链可变区进行类似VHH的特征性改造,可以使这些抗体在保持亲和力、特异性不变或者变化很小的情况下,优化抗体的其它性质。已有的研究表明VHH抗体作为一种小型化的基因工程抗体在基础研究、药物开发等领域有广阔的应用前景。

双峰驼天然单域抗体库的构建及鉴定

重链抗体的可变区VHH是目前天然存在的具有完整功能的最小抗体分子片段,该抗体在基础研究、药物开发等领域应用前景极为广阔。为了构建双峰驼天然单域抗体库并对其进行初步鉴定,从5峰未经免疫的健康骆驼全血中分离淋巴细胞,提取其总RNA,之后反转录为cDNA,利用PCR技术扩增全套编码重链抗体可变区的基因序列,将经过回收并酶切纯化的VHH序列克隆到噬菌体载体上,电转化大肠杆菌TG1感受态细胞,共转化343次。结果表明,构建的双峰驼天然单域抗体库库容为4.4×10~7,转化阳性率为75%,多样性良好,体现为CDR3区碱基序列及长度存在显著差异。成功地构建了双峰驼天然单域抗体库,为今后从中筛选出具有应用价值的特异性单域抗体奠定了基础。

单域重链抗体的分子特征

源于软骨鱼或骆驼科动物的同型重链二聚体无轻链,用基因工程方法获得其单一重链可变区可保留完整的抗原结合活性,称为单域重链抗体。单域重链抗体具有分子小、稳定性高、体内组织渗透性好、可溶性好、易表达、抗原识别表位独特的结构特征,近年来在生物技术研究与诊断治疗应用领域得到广泛关注,取得了快速发展。

黑色素瘤细胞单域抗体文库的构建及鉴定

黑色素瘤作为一种多发于皮肤部位的恶性肿瘤,严重危害着动物和人们的健康。与传统抗体比较,单域抗体具有结构简单、分子量小、免疫原性弱等特点,使其在疾病的诊断及治疗方面具有广阔的应用空间。本研究以B16-F10细胞蛋白质为研究对象,通过反复冻融与超声破碎相结合的方式获得B16-F10蛋白质作为抗原,免疫成年雄性羊驼。采用噬菌体单域抗体展示技术,构建了质量优良的B16-F10细胞蛋白质单域抗体免疫文库,其库容为5.76×1010,VHH重组率为96%,文库丰度为3.00×1010个/mL。该结果为研究黑色素瘤的生物学特性提供了新思路,同时也为后续筛选B16-F10单域抗体奠定了基础。

鼠抗人TNF-α单域抗体基因在大肠杆菌中的融合表达

目的： Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 法获得鼠抗人肿瘤坏死因子α（ｈ Ｔ Ｎ Ｆα）单克隆抗体 Ｅ６ 轻、重链可变区基因序列，分别构建融合表达载体 ｐ Ｇ Ｅ６ Ｖ Ｈ 和ｐ Ｇ Ｅ６ Ｖ Ｌ，利用大肠杆菌系统表达 Ｖ Ｈ和 Ｖ Ｌ单域抗体蛋白． 方法：将 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 法获得的 Ｅ６ Ｖ Ｈ 和 Ｅ６ Ｖ Ｌ基因分别克隆入融合表达载体 ｐ Ｇ Ｅ Ｘ４ Ｔ１ 中，使它们受控于 Ｐｔａｃ 启动子， 转化大肠杆菌 Ｄ Ｈ５α，经异丙基β Ｄ硫代半乳糖苷（ Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ）诱导，１００ ｇ／ Ｌ Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ检测表达产物．结果： Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ显示 Ｅ６ Ｖ Ｈ 表达产物分子质量约为 ３８ ｋｕ， Ｅ６ Ｖ Ｌ表达产物分子质量约为 ３７ ｋｕ，与预期结果相符． 光密度扫描结果表明，谷胱甘肽巯基转移酶（ Ｇ Ｓ Ｔ） Ｖ Ｈ 融合蛋白占菌体总蛋白的 ４５％ ， Ｇ Ｓ Ｔ Ｖ Ｌ 融合蛋白占菌体总蛋白的３６％ ， Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 证实在相应分子质量处，有 Ｇ Ｓ Ｔ Ｖ Ｈ 和 Ｇ Ｓ Ｔ Ｖ Ｌ融合蛋白的显色条带． 结论：在大肠杆菌 Ｄ Ｈ５α中成功地表达了ｈ Ｔ Ｎ Ｆα的单域抗体基因．

基于计算生物学方法的小容量单域抗体库的构建及食品中雌二醇特异性抗体的筛选

目的构建骆驼源单域抗体实体库和虚拟库,为快速筛选检测食品中小分子污染物的特异性抗体提供新方法。方法通过基因克隆、一代测序、同源性分析的方法构建骆驼源单域抗体基因库,通过二级结构分析和同源建模的方法建立单域抗体的三维结构虚拟库,利用分子对接技术实现雌二醇特异性抗体的虚拟筛选,并以雌二醇小分子为靶标进行初步验证。结果构建的小容量单域抗体库含有2000株抗体,每一株抗体的遗传背景、蛋白质结构及抗体抗原互补决定区(CDR)的信息清晰;通过分子对接得到结合雌二醇小分子能力最高的一株抗体的半经验结合自由能绝对值为9.56;相互作用分析结果显示,单域抗体结构中和雌二醇小分子发生相互作用的主要为3个CDR区形成的loop结构,经间接ELISA验证,其和雌二醇结合的50%抑制率(IC50)值为20 ng/ml,检测限(LOD,IC10)为4.097 ng/ml。结论通过计算生物学和基因工程技术相结合的方法构建的骆驼源单域抗体库,针对食品中常见的激素类兽药雌二醇,可以筛选得到背景清晰、具有较高亲和力的特异性抗体。

重组骆驼源单域抗体的原核表达及纯化

目的:原核表达重组骆驼源单域抗体并纯化。方法:将雌二醇特异性的单域抗体基因片段克隆到pET32a载体中,经IPTG诱导表达后对形成的包涵体进行纯化,利用间接ELISA法检测获得的单域抗体的活性,并以孕酮、雌酮和雌三醇为对照,鉴定雌二醇单域抗体的特异性。结果:重组雌二醇单域抗体的相对分子质量约为34×103,通过大肠杆菌BL21(DE3)-p ET32a构建的原核表达体系实现了雌二醇单域抗体的高水平表达,并通过包涵体纯化获得了可溶性的高纯度单域抗体抗体,经间接ELISA检测,该雌二醇特异性抗体的50%抑制浓度(IC50)为20.03 ng/mL,对孕酮和雌酮2种化合物的交叉反应率分别为29.78%和1.63%,特异性较好。结论:通过构建原核表达体系,可以获得功能性的骆驼源单域抗体。