大鼠胰岛细胞单层培养模型的建立和应用

目前用于体外胰岛功能研究的细胞模型系统有两大类,一是从正常动物胰腺组织分离的胰岛,二是由胰岛素瘤细胞克隆产生胰岛素的胰岛细胞系。在研究葡萄糖对胰岛分泌功能的影响时,使用从正常胰腺组织所分离的胰岛较为理想,但可获得的组织量过少,而从瘤组织克隆的细胞系虽可获得大量同源细胞成分,但该类细胞对刺激反应常弱化,不能如实地反应生物体的正常功能。有鉴于此,本实验采用正常大鼠胰岛细胞单层培养技术,获得了具有良好功能和形态的胰岛细胞,结果报告如下。

人胎胰岛细胞单层培养方法的进一步探讨

目的 :改良消化培养人胎胰岛细胞培养方法。方法 :用V型胶原酶2g/L和DispaceII0.3g/L在32℃水浴消化分离胰腺组织 ,通过转皿和碘乙酸结合的方法消除成纤维细胞 ,将先消化好的胰岛细胞及时转皿保护 ,适度调整培养液 pH和控制CO2 气体量。结果 :成功地培养了人胎胰岛细胞。结论 :掌握好以上环节可大幅度提高胰岛细胞获得率。

猪垂体细胞单层培养

本研究建立了猪垂体前叶细胞单层培养模型 ,并进行了免疫细胞化学研究。结果显示 ,用 0 2 5 %胶原酶 ,0 0 5 %透明质酸酶和 0 0 1%DNA酶消化垂体前叶 2次 ,每个垂体可获 5× 10 8个细胞 ,细胞活率在 90 %以上。用含 10 %小牛血清的McCoy’s 5A培养液培养 2 0h ,细胞贴壁 ,4 0h左右形成单层 ,形成单层后换无血清培养液仍维持生长。抗LH和FSH免疫细胞化学染色表明 ,大多数LH阳性细胞同时也是FSH阳性细胞。在单层细胞中 ,LH和FSH阳性细胞占细胞总数的比例不足 10 %。

新生大鼠胰岛细胞的体外单层培养

胰岛细胞体外培养中成纤维细胞的过度生长是影响胰岛细胞贴壁率的主要因素，曾经采用多种方法以限制成纤维细胞的生长，有的效果不理想，有的方法较复杂。作者采用接种后两次转板的方法，使成纤维细胞明显减少，胰岛细胞贴壁成活率提高，且方法简便。１材料与方法１．１胰...

人工合成多肽(P-15)对单层培养胰岛细胞的作用

观察人工合成多肽(P-15)对新生大鼠单层培养胰岛细胞胰岛素分泌和胰岛素基因表达的作用。含有16.7mmol/L 葡萄糖的 TCM 199培养基培养24小时的 Wistar 大鼠单层胰岛细胞被 P-15(浓度分别为0、0.72、7.2、36μmol/L)刺激30、90分钟。结果表明,短时期内 P-15对胰岛细胞产生刺激分泌效果,长时间7.2μmol/L P-15既增加胰岛素的分泌,也刺激胰岛素的基因表达,高浓度(36μmol/L)却丧失了这种刺激效果。

单层培养的人关节软骨细胞生物学行为研究

目的:研究单层培养的人关节软骨细胞生物学行为的改变。方法:对来自8例手术切除负重关节非负重区的软骨细胞在10%DMEM中进行单层传代培养,观察细胞形态学、增殖细胞倍增时间(DT)、细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色以及流式细胞分析细胞增殖指数(PI)和细胞凋亡。结果:随着传代次数的增加,(1)细胞形态由原代的多角形转变为第3、4代的短梭形、第8、9代的成纤维细胞形态;(2)DT在逐渐延长,PI在逐渐减小;(3)细胞分泌的Ⅱ型胶原逐渐减少;(4)细胞凋亡指数未见明显的改变(P>0.05)。结论:体外单层培养的关节软骨细胞存在着失分化和老化,但第3、4代能较好地保持软骨细胞的生物学行为,可作为种子细胞的来源。

单层培养细胞总RNA两种提取方法的比较

目的探讨单层培养细胞总RNA提取过程中先行细胞消化或离心富集对所提RNA质量是否产生影响。方法培养NGF诱导的PC12细胞,采用Trizol试剂提取RNA:离心组(A)先将贴壁生长细胞经胰酶消化、离心获得细胞沉淀,加入1 ml Trizol进行RNA提取;直接组(B)将培养液弃尽后直接加入Trizol试剂(1 ml/10 cm2瓶壁)进行RNA提取;均采用琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性,紫外分光光度仪测定RNA浓度和OD260/OD280比值。结果凝胶电泳结果显示,直接组出现3条清晰的条带(28S、18S和5S条带),离心组在电泳末端5S区出现粗大的条带。两组OD260/OD28比值相似,约为1.6。直接组组间样品间RNA浓度相差较大。结论采用离心法和直接法提取贴壁细胞总RNA,先行细胞离心富集增加了RNA降解机会,直接法提取的RNA质量较高,考虑对后续实验的影响,直接法更优于离心法。

神经干细胞的单层培养及分化过程中HES1和MASH1的表达变化

【目的】建立神经干细胞(NSC)体外培养方案,使NSC的体外可以得到增殖和分化,并检测NSC分化过程中HES1和MASH1的表达变化。【方法】无菌条件下取SD大鼠胚胎端脑,无血清悬浮培养,形成P2代神经球后,将神经球消化成单细胞,分为神经球悬浮培养和单层贴壁培养,并对两种不同培养方式下的NSC进行干性鉴定和分化能力鉴定。用不同浓度(20、40、80μg/L)的脑源性神经生长因子(BDNF)诱导NSC分化,选出最合适的浓度。用BDNF最佳诱导浓度诱导NSC分化,Q-PCR检测分化过程中HES1和MASH1的表达变化。【结果】神经球悬浮培养和单层贴壁培养均可得到的NSC;分化3 d后,在不加入任何诱导因素的情况下,单层贴壁培养的NSC能更高比例[(19.55±1.09)%]地分化为β-tubulinⅢ阳性细胞;BDNF 40μg/L能诱导出更多的β-tubulinⅢ阳性细胞[(34.17±0.60)%];在分化1、3和7 d时,Q-OCR结果表明MASH1在BDNF诱导下组较NSC和对照组表达水平明显上升。【结论】单层贴壁培养的神经干细胞更利于分化为神经元,BDNF为40μg/L时能诱导出更高比例的神经元,BDNF可以诱导MASH1在NSC分化过程中表达明显上升。

肾上腺皮质细胞的单层培养方法

目的 :体外单层培养大鼠肾上腺皮质细胞 ,以便为肾上腺皮质细胞的有关实验提供必要条件。方法 :采用胶原酶Ⅱ、透明质酸酶消化等步骤分离Wistar大鼠的肾上腺皮质细胞 ;分离的细胞于含 15 %NBS的DMEM培养基、37℃、5 %CO2 的环境中培养 ,3β 羟基类固醇脱氢酶特异染色鉴定。结果 :培养的肾上腺皮质细胞呈梭形 ,胞体较大、有少量突起 ,3β 羟基类固醇脱氢酶特异染色后胞体显著着蓝色。肾上腺皮质细胞不呈典型的“S”形增殖趋势 ,适于作原代培养。上皮样细胞和成纤维样细胞同时存在。结论 :通过细胞形态观察及特异酶染色鉴定 ,本文培养的细胞为大鼠肾上腺皮质细胞。

内分泌胰细胞单层培养及其应用

本文介绍内分泌胰细胞单层培养基本方法及要求和培养过程中遇到的内分泌细胞富集及贴壁、成纤维细胞去除等问题的近展。文章还介绍此内分泌胰单层细胞系统的应用。

正常人皮肤体外单层培养中四倍体增多

正常人皮肤体外单层培养四倍体增多被认为体内有某些肿瘤倾向基因的体外表达。鉴定出具有癌的遗传风险,肿瘤学的监护才有可能。最近通过对患癌的家属成员和某些有癌风险的家族成员的皮肤单层培养,根据其生物学特性(生长动力学和染色体)的改变可检出几种常染色体显性癌综合征的基因体外表达。

地塞米松对单层培养的大鼠肝细胞分泌机能的影响

目的 研究地塞米松对大鼠肝细胞分泌机能的影响。方法 用Seglen两步灌注法从F3 4 4大鼠肝脏中灌注并以低温离心分离肝细胞 ,然后单层培养。在Willam’sE培养基中加入地塞米松 ,通过位相差显微镜观察细胞形态 ;并通过荧光染料分泌实验及Rhodamin Phallodine染色后荧光显微镜观察胆汁分泌机能和细胞骨架的改变。结果 培养基中加入地塞米松后 ,肝细胞毛细胆管样结构扩张 ,荧光染料在扩张的毛细胆管样结构中聚集 ,细胞骨架蛋白在毛细胆管样结构周围聚集。结论 地塞米松促进大鼠肝细胞胆汁分泌 。

神经干细胞球和单层贴壁神经干细胞的培养及鉴定

目的：探讨小鼠大脑皮层源性神经干细胞（NSCs）体外培养的两种方法并对培养的细胞进行鉴定。方法：分别取孕14-16d的昆明小鼠胚胎脑皮质并用细胞球悬浮培养和单层贴壁培养两种方法进行体外培养，用光学显微镜观察NSCs的生长情况，并用免疫细胞化学鉴定NSCs特异性抗原的表达，经过血清对NSCs分化诱导后进行胶质纤维酸性蛋白及微管相关蛋白．2的检测。结果：①培养出来的细胞可以扩增生长；②这两种方法分别培养的神经干细胞球和单层神经干细胞经抗巢蛋白免疫细胞染色均呈阳性；③两种培养方法培养出的NSCs经诱导分化后，免疫细胞化学染色显示微管相关蛋白-2、神经胶质酸性蛋白染色阳性。结论：采用无血清培养基中加入特定生长因子的神经干细胞球培养和单层贴壁两种培养技术，可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的NSCs。

体外重建皮肤及单层培养角质形成细胞对模拟日光紫外线照射的分子应答

白种人的皮肤癌发病率已经高于过去的40年，主要原因是人们开始改变自己的生活习惯，外出度假而将自己过度暴露于日光下。现已确定，非黑素瘤皮肤癌发生的首要、而且是主要步骤为紫外线诱导的突变。UVB辐射（290-320nm）在诱导环丁烷嘧啶二聚体和6-4光产物中影响显著，这两种损害均具有高突变性。目前已有相关的人类基因突变的研究报道，特别是着色性干皮病，由于紫外线诱导DNA损伤的修复障碍而使该病患者发生皮肤癌的概率增加。

单层法诱导小鼠胚胎干细胞的成骨分化研究

目的以单层贴壁方法,高浓度维甲酸处理小鼠胚胎干细胞,以期建立一种高效成骨诱导的新体系。方法将差速贴壁后的小鼠胚胎干细胞以1.5×104个/cm2的密度接种,成骨培养液+10μmol/ml维甲酸诱导,4d后更换为成骨诱导液,直至28d,同时通过细胞的形态学观察、RT-PCR、茜素红染色对其成骨分化进行鉴定。结果随着分化时间的延长,胚胎干细胞逐渐分化为梭形细胞,且呈漩涡状排列,至分化15d左右产生结节样团块,21d时结节样物质较普遍。RT-PCR检测表明成骨诱导14d时,表达CD73+和I型胶原,说明细胞继续向成骨分化,且已进入了基质分泌阶段。21d时,表达Ⅰ型胶原和骨钙素,表明已产生了成熟的成骨细胞,并进入了矿化后期。同时成骨诱导28d时,茜素红染色显示细胞已产生大量钙结节。结论以高浓度维甲酸,在单层贴壁状态下对小鼠胚胎干细胞进行诱导,可获得大量成熟、具备矿质化特性的成骨细胞,为成骨细胞的体外诱导分化提供了新的途径,同时该体系也成为体外探讨成骨细胞表型决定机制的一个重要模型。

烧伤后PMN粘附对肺微血管内皮细胞单层通透性的影响

目的：观察烧伤后中性粒细胞（ＰＭＮ）对肺微血管内皮细胞单层通透性的影响，分析ＰＭＮ粘附及其粘附分子ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８在该影响中的介导作用。方法：建立培养肺微血管内皮细胞（ＰＭＥＣ）单层通透性测定的方法，根据处理内皮细胞单层的不同成分，将实验分为７组，用含ＦＩＴＣ－清蛋白的灌流液灌流后，测定液体滤过系数（Ｋｆ）和渗透压反射系数（δ）。结果：烧伤后ＰＭＮ能使反映小分子物质通透性的Ｋｆ值明显增加，使δ显著下降。用单抗封闭ＰＭＮ膜上ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８能使δ值的变化得到纠正；用孔径０．２μｍ的滤膜阻断ＰＭＮ与内皮细胞单层的粘附则使Ｋｆ值和δ值均接近正常水平。结论：白细胞与内皮细胞的粘附是介质类物质发生作用的前提条件，这些物质主要影响肺血管对小分子物质的通透性。粘附分子ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８本身可能具有生物学信号调控的作用。

大鼠螺旋神经节干细胞体外优化培养方法的研究

目的探索贴壁法进行螺旋神经节(Spiral Ganglion,SG)干细胞培养,同时与传统悬浮培养法对比培养的SG干细胞形态、增殖效率及分化表型。方法取新生1天SD大鼠耳蜗的螺旋神经节位置,以悬浮和单层贴壁的方式进行培养,观察SG干细胞的形态学特点。通过活/死细胞染色和Annexin-V/PI双染法比较其生长状态。通过Nestin、Sox2、Ki67等免疫荧光染色及生长曲线测定等方法对其增殖能力进行比较分析。体外胎牛血清诱导SG干细胞分化,通过Tuj1免疫荧光染色鉴定分化表型并比较分化效率。结果两种培养方式均可获得状态良好的高纯度SG干细胞,免疫荧光染色和生长曲线测定结果提示贴壁培养的干细胞的增殖活性较悬浮培养的干细胞更强。诱导分化后,两种培养方式获得的SG干细胞均可分化为Tuj1染色阳性的双极神经元样细胞。结论本研究结果表明单层贴壁可培养出状态良好的SG干细胞,并且其增殖能力较悬浮培养的干细胞更强。贴壁培养的干细胞可被可成功诱导分化为神经元。提示单层贴壁方式可作为一种稳定的SG干细胞培养方法,从而为SG干细胞的相关研究提供重要技术支持。

人髂骨生长板软骨细胞的体外培养及鉴定

[目的]探讨人髂骨生长板软骨细胞体外培养的可行性并观察其生物学特征。[方法]对手术中获得的10例青少年特发性脊柱侧凸患者髂骨生长板软骨行体外分离、培养,观察细胞形态,MTT法测定细胞增殖,Ⅱ型胶原免疫组化染色,采用逆转录聚合酶链反应检测各代细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达水平。[结果](1)体外培养的软骨细胞随着传代次数的增加,细胞形态由原代的多角形逐渐变为长梭形;(2)MTT比色法检测显示,第2代髂软骨细胞的生长曲线近似倒"S"形,在第4～8d细胞呈对数生长,在9～10d达平台期,至第11d开始出现生长抑制。(3)第2代细胞Ⅱ型胶原免疫组化呈强阳性。(4)Ⅱ型胶原mRNA表达水平从第2代后随着传代次数的增加逐渐下降。[结论]采用联合酶序贯消化法将软骨细胞悬液和软骨块共同体外培养髂软骨细胞简单、有效,P2代细胞很好的保持了软骨细胞的特性,可以作为种子细胞来源。